研究背景端粒酶是一种专一依赖RNA的逆转录酶,与细胞调控及恶性肿瘤形成密切相关,其活性升高是细胞永生化和恶性转化过程中最重要的特征之一。人端粒酶包括3种组分:端粒酶RNA(human telomersase RNA,hTR)、端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)及连结二者的端粒酶连结蛋白(Telomerase associated protein1, TP1)。其中hTERT与端粒酶活性密切相关,被认为是大多数细胞端粒酶激活的限速酶[1]。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylases inhibitors, HDACi)曲古抑菌素A(Trichostatin A, TSA)通过抑制组蛋白去乙酰化酶使细胞乙酰化蛋白增加,选择性抑制和激活细胞大量基因转录,具有特异的肿瘤杀伤效应[2, 3]。因此,本项目从建立Trichostatin A选择性诱导肿瘤细胞凋亡模型入手,观察Trichostatin A诱导宫颈癌细胞凋亡的时间和量效关系。同时检测端粒酶逆转录酶在Trichostatin A诱导宫颈癌细胞凋亡过程中的表达变化,以此为基础,探讨Trichostatin A选择性诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制。实验方法Trichostatin A选择性诱导宫颈癌细胞凋亡模型的建立:(1)倒置相差显微镜下观察Trichostatin A作用宫颈癌细胞形态学变化。(2)磺酰罗丹明B(RSB)法检测Trichostatin A作用宫颈癌细胞凋亡的时间和量效关系;(3)流式细胞仪检测细胞周期改变和凋亡情况。Trichostatin A诱导人宫颈癌细胞凋亡过程中hTERT表达的变化:(1)RT-PCR检测hTERT和p21Waf1基因在Trichostatin A诱导宫颈癌细胞凋亡过程中的变化;(2)激光共聚焦显微镜检测hTERT的细胞定位和表达变化;(3)免疫荧光结合流式检测Trichostatin A作用前后hTERT蛋白表达变化。(4)PCR-TRAP-ELISA法检测hTERT表达变化后端粒酶活性的改变。(5)荧光原位杂交法检测hTERT表达变化后端粒长度的改变。hTERT显性负突变体在Trichostatin A选择性诱导宫颈癌细胞凋亡过程中的作用:(1)稳定转染显性负突变(dominant negative, DN)hTERT、野生型(wild type, WT)hTERT ,观察hTERT在Trichostatin A诱导HeLa细胞凋亡中的作用。( 2 )PCR-TRAP-ELISA法检测转染不同hTERT质粒后端粒酶活性的变化(3)磺酰罗丹明B(RSB)法检测转染不同hTERT质粒的稳定细胞系在Trichostatin A作用下增殖差异;(4)Annexin V/ PI流式检测不同转染细胞系在Trichostatin A作用下的早期凋亡情况。(5)western blot检测不同转染细胞系在Trichostatin A作用下p21waf1和p53的表达变化。结果通过Trichostatin A选择性诱导宫颈癌细胞凋亡模型的建立,观察到宫颈癌细胞在Trichostatin A作用下细胞发生明显变化,细胞折光性降低;48h后细胞变圆飘浮,胞膜皱缩,可见凋亡小体和核碎裂;RSB法证实Trichostatin A对宫颈癌细胞的增殖抑制随药物浓度的增加和作用时间的延长而明显,具有显著的时效和量效相关性。流式细胞检测证明Trichostatin A作用宫颈癌细胞后细胞周期阻滞,随后细胞发生凋亡。Trichostatin A作用细胞后,hTERT mRNA随诱导时间的变化具有一定的动态规律,而p21waf1的表达则升高。激光共聚焦显微镜和免疫荧光结合流式细胞仪分析从蛋白水平验证了mRNA水平的动态变化。而进一步的端粒酶活性检测和端粒长度的测定也证实了端粒酶活性和端粒长度随hTERT的表达变化发生相应的改变。以上结果提示hTERT有可能成为Trichostatin A的作用靶点。稳定转染显性负突变(dominant negative,DN)hTERT、野生型(wild type,WT)hTERT后,转染DN-hTERT的细胞端粒酶的活性明显下降,而转染WT-hTERT的细胞端粒酶活性则升高。端粒酶活性在不同的稳定转染细胞系的差异进一步表现在细胞增殖和对Trichostatin A诱导凋亡的耐受方面:转染DN-hTERT的细胞增殖速度减慢,对Trichostatin A诱导的凋亡敏感,而转染WT-hTERT的细胞则相反。Western blot检测这种凋亡上的差异有可能是由于不同转染细胞系p21waf1表达的差异引起,这种差异不依赖于p53的表达变化。结论1 Trichostatin A可以选择性诱导宫颈癌细胞凋亡。2 hTERT在Trichostatin A诱导宫颈癌细胞凋亡过程中表达发生一定的变化。3 hTERT作为Trichostatin A的作用靶点,外源性干预其表达可以改变肿瘤细胞对Trichostatin A的敏感性,这种敏感性的改变通过细胞周期调控蛋白p21waf1实现。研究背景组蛋白去乙酰化酶抑制剂是一类新型的非细胞毒类抗癌化疗药物,在I、II期临床试验中取得了令人振奋的结果,显示出良好的临床应用前景。作为一种新的肿瘤治疗概念,HDAC抑制剂与传统的细胞毒类化疗药物不同,其具有在肿瘤与宿主正常细胞间选择性杀灭肿瘤细胞的特性,说明其核心作用靶点具有明显的肿瘤特异性。然而,国内外对HDAC抑制剂的广谱抗肿瘤的作用靶点的认识仍然不够明确。虽然有报道显示一些细胞周期调控蛋白可能作为其靶点,但类似的研究仍然是零散、相对不完善的,因此,我们在第一部分研究的基础上,采用一种全新的,基于功能效应为基础的筛选手段:SMART(Suppression of Mortality by Antisense Rescue Techique)技术克隆HDAC抑制剂的作用靶点,试图以一种新的角度来阐明HDAC抑制剂特异性抗肿瘤的作用机理,发现其新的作用靶点,发展肿瘤细胞凋亡的新的调控机制。实验方法Trichostatin A诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡反义cDNA文库的构建和凋亡效应基因的筛选及鉴定:实验路线及流程见下表:SMART技术平台流程图结果经MTT,流式细胞仪证实250nmol/L Trichostatin A能诱导MCF-7和HeLa细胞凋亡,提取处于凋亡不同时期的MCF-7细胞mRNA,提取mRNA后建立的反义cDNA文库片段插入率大于90%,平均长度约为1.5kb,库容约为2×105;将此文库质粒DNA转染HeLa细胞,经过筛选得到阳性克隆后,Hirt DNA提取转化,经酶切测序获得76个EST片度。经过生物信息学分析,选定Liv-1、Smad4和Ubiquitin B进行了详细的机制研究。结论1.成功建立了HDAC抑制剂Trichostatin A诱导细胞凋亡的SMART技术平台。2.利用SMART技术平台和生物信息学分析,筛选得到76个效应克隆。3.对文库筛选出来的效应克隆Liv-1、Smad4和Ubiquitin B进行了详细的机制研究