外泌体,直径约30-150 nm的脂质双层膜囊泡,所有的细胞几乎均可以分泌,广泛分布于血液、尿液、眼泪、唾液、乳汁、脑脊液等多种体液中。外泌体携带着起源细胞的多种物质,介导着细胞间的通讯机制,在生理和病理机制下都发挥着显著作用。相比于循环肿瘤细胞以及循环DNA,外泌体数量更多,更容易富集,且双层膜结构可以保护内部的核酸物质避免降解,蛋白又可以提供机体的多种信息。因此,外泌体作为一种无侵入性的、新型的肿瘤标志物引起学者的广泛研究。外泌体的数量变化以及外泌体表面的蛋白表达均与癌症的发生和发展有一定的相关性。然而目前基于外泌体数量的测定方法均无法对外泌体的数量进行精准测量。同时,多种癌症存在着肿瘤异质性,不同的亚型具有不同的临床行为和表达的蛋白有所差异,目前仍缺乏对外泌体肿瘤标志物的联合检测技术。电化学生物传感技术有着操作简单、性能稳定、灵敏度高和仪器便携化等优点,在外泌体的检测方面引起了科研工作者的广泛关注。采用电化学生物传感技术实现外泌体数量的精准检测和对外泌体表面的蛋白进行联合分析对癌症的早期诊断,临床检测和预后判断都有着极其重要的研究意义。电化学细胞交流阻抗技术（ECIS）是对细胞施加微小的扰动信号,通过采集体系的阻抗信号变化来监测细胞生长状态的一种技术。细胞交流阻抗技术作为一种无创、无标记、实时检测细胞行为的监测方法已引起广泛关注。ECIS技术可以克服体外常规终点检测的局限性,已被广泛用于细胞行为的检测,伤口愈合的监测,癌细胞的鉴定和细胞毒性的研究。生活中存在多种有毒物质,这些有毒物质可导致DNA损伤,细胞遗传信息转化和各种癌症等。通过细胞交流阻抗技术来评估有毒物质的细胞毒性已引起许多科研学者的密切关注,对毒性物质实时、连续的细胞毒性监测有着重要的研究意义。本论文的主要研究在于设计一系列的电化学生物传感用于癌症外泌体的超灵敏检测以及有毒物质的细胞毒性评价。实验中利用点击化学技术,主客体识别技术,DNA杂交链式反应和纳米粒子放大技术以及细胞交流阻抗技术,设计了一系列电化学生物传感平台实现了对外泌体数量,外泌体表面肿瘤标志物,外泌体表面糖蛋白以及香烟有害物质细胞毒性的灵敏检测。本论文为电化学生物传感方法在外泌体的超灵敏检测和有毒物质的细胞毒性评价方面提供了新的策略和研究思路。本论文具体的研究工作如下:（1）设计了一种基于点击化学和DNA杂交链式反应酶催化放大信号的超灵敏电化学生物传感用于肿瘤外泌体数量的检测。该传感通过在电极上沉积还原氧化石墨烯以及树状金纳米粒子来提高电极的导电性。CD63蛋白在外泌体表面广泛表达,选用CD63适配体修饰玻碳电极用于外泌体的抓捕。4-氧-2-壬烯炔（alkynyl-4-ONE）,一种功能化的脂质亲电试剂,其醛基与外泌体表面蛋白的氨基反应。随后,修饰有叠氮基团的DNA引发链通过一价铜催化的点击化学反应高效结合到外泌体表面,并且在加入辅助DNA链后,自主装形成DNA杂交链式反应用于信号的放大。通过链霉素和生物素反应结合到DNA超级链上的辣根过氧化物酶可以催化过氧化氢和邻苯二氨的反应。通过测定产物2,3-二氨基吩嗪还原电流的大小来实现外泌体浓度的定量。在优化的实验条件下,该方法可以检测外泌体的线性范围为1.12×10²-1.12×10⁸个/μL,检测限为96个/μL。不同于抗体或适配体的特异性识别,该传感器使用alkynyl-4-ONE与外泌体表面蛋白质发生非特异性结合,防止外泌体亚群的遗漏。在实际人类血清的样品检测中也显示了优良的测试性能,在临床检测应用中前景广阔。（2）开发了一种基于磁介导和主客体识别的适配体电化学生物传感,用于肿瘤外泌体表面蛋白的联合检测。乳腺癌,作为一种异质性疾病,存在多种亚型,实验选用MCF-7,SK-BR-3,MDA-MB-231和BT474细胞分泌的外泌体为研究模型,MUC1,HER2,Ep CAM和CEA蛋白被选用作为乳腺癌的肿瘤标志物。CD63蛋白在许多乳腺癌外泌体的表面上广泛且高度表达,因此修饰在磁珠上的CD63适配体用于外泌体的特异性抓捕。具有氨基,二硫键和二茂铁多个官能团的N-(2-（（（2-氨基乙基）二硫烷基）乙基）二茂铁羧酰胺（Fc NHSSNH₂）分子通过氨基和醛基的反应偶联到Si O₂ NPs表面用作信号分子,而不同的适配体修饰到Si O₂ NPs上特异性识别外泌体表面的蛋白。MB探针、外泌体和Si O₂ NPs探针形成夹心结构,通过磁铁从溶液中分离。随后加入还原剂（二硫苏糖醇,DTT）破坏Fc NHSSNH₂的二硫键将N-（2-巯基乙基）二茂铁羧酰胺（Fc NHSH）释放到上清液中,通过主客体识别作用被捕获到氧化石墨烯-葫芦脲[7]（GO-CB[7]）修饰的丝网印刷碳电极（SPCE）上。通过测定Fc NHSH的氧化电流来定量外泌体表面的蛋白量。该传感器可以准确而灵敏地同时检测出不同乳腺癌外泌体表面上的四种肿瘤标记物,可以区分外泌体表面蛋白的细微变化。作为乳腺癌外泌体肿瘤标志物的联合检测技术,在人类血清样品的测定中显示出巨大的潜力,对临床诊断具有广阔的应用前景。（3）设计了一种基于硼酸识别糖蛋白和纳米粒子放大信号的比率型电化学传感用于外泌体表面糖蛋白的高灵敏检测。在本实验中,首先制备了由Fc NHSSNH₂分子和CD63适配体修饰的Si O₂ NPs粒子探针。Si O₂ NPs探针通过Fc NHSSNH₂分子与氧化石墨烯-葫芦脲[7]（GO-CB[7]）发生主客体识别被固定在玻碳电极的表面,其中Fc NHSSNH₂分子用作传感器的内参信号,CD63适配体用于外泌体的特异性抓捕。硼酸会与糖蛋白中的顺式二醇结构发生特异性结合,实验选用4-巯基苯硼酸（MPBA）代替传统的抗体和适配体用于外泌体表面的糖蛋白识别。MPBA利用巯基和Ag NPs的作用修饰到Si O₂@Ag纳米粒子上。当存在外泌体,MPBA-Si O₂@Ag纳米粒子探针会被抓捕到玻碳电极上,其中具有大比表面积的Si O₂NPs结合较多的Ag NPs用于电化学信号的放大。实验结果以Ag NPs与Fc NHSSNH₂的电化学信号比值表示,内参分子Fc NHSSNH₂的引入可以有效降低由于基底不同的DNA密度引起的测量误差,提高检测的准确度和灵敏度。该传感有着好的选择性和重现性,在实际血清样品中也显示了良好的测试性能,在临床外泌体糖蛋白的检测中有着潜在的应用前景。（4）设计了一种电化学细胞交流阻抗传感器（ECIS）用于4种有毒物质的细胞毒性评估。本实验自制了一个简便的ECIS装置,由导电性良好的氧化铟锡（ITO）玻璃做工作电极,稳定性良好和表面积大的铂网用来做对电极和参比电极,生物相容性良好的聚二甲基硅氧烷（PDMS）做密封圈,无毒的聚四氟乙烯（PTFE）腔室做细胞培养池,该装置能够实现细胞阻抗的实时监测和同步细胞成像。中国仓鼠卵巢细胞（CHO-K1）由于繁殖快,易培养和对香烟烟雾敏感等优点被选择作为细胞毒性测定的研究模型。选用4-（甲基亚硝基氨基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）,尼古丁,高焦油和低焦油香烟烟气总颗粒物质（TPM）为毒性物质研究模型,研究了4种毒性物质对CHO-K1细胞的毒性影响和细胞的自我恢复能力。ECIS的测试结果进一步与传统的中性红摄取实验做了比较,通过对比细胞存活率和半致死浓度IC50,ECIS技术显示了更高的灵敏度。不同与传统的终点检测方法,该ECIS技术可以实时、连续、无标记的测定有害物质的细胞毒性。