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抗体是体液免疫系统的重要组成部分，也在生命科学研究、疫病检测和医药领域发挥着重要作用。噬菌体展示技术是人源治疗性抗体的重要技术来源之一。TNF-α是一种前炎症因子，与风湿性关节炎等多种疾病的发生密切相关。本研究采用噬菌体抗体展示技术构建一个人源噬菌体抗体库，并从中筛选出具有TNF-α细胞毒活性抑制作用的人源单链抗体。依据文献报道的人抗体恒定区序列及人源抗体各胚系基因序列，本研究设计42条引物，以200份人外周血中分离的总RNA为模板，利用这些引物扩增出了抗体的重链（VH）和轻链（VL）可变区基因。抗体重链可变区的扩增和组装采用三轮OE-PCR反应完成：首先分别扩增VH的CDR1、CDR2、CDR3和FR3，然后采用OE-PCR拼接重链的CDR1和CDR2、CDR3和FR3的基因片段，再将两者拼接成完整的人抗体VH基因。VL基因的扩增采用PCR方法从总RNA中经多次反应获得，再将其与VH基因连接形成完整的scFv基因。噬菌体库的构建采用载体pCANTAB5E、E.coli TG1和辅助性噬菌体M13KO7。将scFv基因插入pCANTAB5E载体酶切位点Sfi I和Not I之间，并将新载体转化E.coli TG1。辅助噬菌体M13KO7侵染转化后的TG1，构建scFv噬菌体库。梯度稀释法测得噬菌体库库容为2.5×107，噬菌体滴度为1012pfu。基因测序显示E.coli TG1中转化DNA与预期相符，抗体重链各区域组合正确，VH和VL之间有柔性多肽编码基因相连。采用微孔板筛选法以人TNF-α、禽流感NS1蛋白、人血清白蛋白HSA、牛血清白蛋白OVA和PRRSV病毒GP5蛋白对文库进行淘选，结果显示五种蛋白在淘选过程中均能有效富集。为获得高亲和力的抗TNF-α抗体，依据phage ELISA实验结果从随机挑选的87株重组噬菌体中筛选出4株阳性克隆进行重组蛋白表达和抗TNF-α活性测试。重组蛋白的表达采用pET-28a载体和大肠杆菌BL21（DE3）菌株。IPTG诱导后SDS-PAGE电泳显示scFv重组蛋白在大肠杆菌中大量表达，重组蛋白的表达量占菌体量的40%左右，经镍柱纯化的蛋白纯度在90%以上。MTT法检测TNF-α杀伤L292细胞的活性，显示在放线菌素为10μg/mL时，TNF-α的ED50为0.01ng/mL。重组蛋白B11和A24对TNF-α的IC50分别为70μg/mL和100μg/mL。本研究构建、鉴定了人源scFv噬菌体抗体库，并从中筛选了2株具有抗TNF-α活性的人源scFv，为抗TNF-α抗体药物的研发奠定了基础。