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目的:
经皮冠状动脉介入治疗(PCI)技术的广泛应用，显著地改善了冠心病的临床疗效及预后，但PCI术中对血管的机械损伤等所导致的术后血管内再狭窄，仍是当今临床上未能解决的重要问题[1]。目前的研究表明，再狭窄的发生主要与内皮损伤和血管平滑肌细胞增殖、迁移等所致的新生内膜增生及血管重塑有关。本研究小组前期研究显示[2]：MSCs移植能在一定程度上促进损伤动脉内皮的修复，从而减轻术后血管内狭窄的程度，但其对血管平滑肌细胞(VSMCs)的作用相对较弱。由此，如果能通过相关目的基因修饰或优化MSCs，使其在保护内皮的同时，加强对VSMCs增殖及内膜增生的抑制作用，可能会有益于进一步降低再狭窄。研究显示：降钙素基因相关肽(CGRP)作为一种广泛存在于心血管系统的血管活性肽，具有显著抑制VSMCs增殖的作用。那么，如果将CGRP基因转染至MSCs，是否会增加MSCs的抗VSCMs增殖的效应呢?为回答这个问题，本课题拟构建含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的CGRP基因的重组慢病毒(lentivirus，Lv)载体(Lv-EGFP-CGRP)并转染至MSCs，首先在体外与VSMCs分组共培养，分别观察其对VSMCs增殖、迁移及表型改变的影响。随后将其体内移植至球囊损伤颈动脉的血管狭窄大鼠模型，在体内观察其CGRP修饰的MSCs移植对损伤动脉VSCMs增殖及表型改变的影响，探讨CGRP修饰MSCs移植在促进损伤动脉内皮化的同时，是否还具有抑制VSMCs增殖等多重作用，从而为基因优化的干细胞移植治疗再狭窄提供一定的理论和实验依据。
方法:
第一部分：贴壁离心法培养大鼠MSCs并通过流式鉴定；将含EGFP和CGRP基因的重组慢病毒载体(LV-EGFP-CGRP)和空病毒载体(LV-EGFP)分别转染至大鼠MSCs。采用荧光显微镜和流式细胞技术(FCM)测定其转染率；RT-PCR和免疫荧光细胞化学检测CGRP的表达，酶联免疫吸附测定(ELISA)检测培养上清液中CGRP的浓度。同时，实验分MSCs-CGRP，MSCs-EGFP和MSCs三组(n=3)，分别对转染后的MSCs进行MTT、β-半乳糖苷酶染色和诱导分化的实验，了解病毒转染对MSCs增殖、衰老和分化的影响。
第二部分：组织贴壁法培养VSMCs；将Lv-EGFP-CGRP和Lv-EGFP转染后的MSCs，分别与同步化后的VSMCs共培养，实验分为Lv-EGFP-CGRP-MSCs+VSMCs(MSCs-CGRP组)、Lv-EGFP-MSCs+VSMCs(MSCs-EGFP组)、MSCs+VSMCs(MSCs组)和VSMCs四个组(对照组)(n=3)。行划痕实验，在显微镜下观察细胞迁移情况，台盼蓝染色检测细胞存活率并计数；同时，共培养48小时后行FCM检测VSMCs细胞周期和凋亡(Annexin V/PI)，WesternBlot检测VSMCs的SM-α-action、OPN蛋白表达。
第三部分：建立大鼠颈动脉球囊损伤模型，将预先准备好的Lv-EGFP-MSCs及Lv-EGFP-CGRP-MSCs于颈动脉球囊损伤后即刻移植至损伤动脉内室温孵育30min，
实验分Lv-EGFP-CGRP-MSC移植组(MSCs-CGRP组，n=20)、Lv-EGFP-MSCs移植组(MSCs组，n=20)和等体积的PBS液注射组(对照组，n=16)。分别于细胞移植后7d、14d和28d取血管组织进行相关指标测定：免疫荧光检测EGFP和CD31观察MSCs归巢和分化情况；Western blot检测局部CGRP的表达，HE染色检测血管组织形态学，免疫组织化学检测局部PCNA表达；Westernblot检测颈动脉VSMCs的SM-α-action、OPN蛋白表达。
结果:
第一部分：成功转染慢病毒的大鼠MSCs可表达绿色荧光，48小时后可稳定表达，当MOI为30时，荧光显微镜及FCM测转染率达80％以上；RT-PCR检测转染后的MSCs有CGRP基因mRNA表达；免疫荧光细胞化学和ELISA检测发现转染CGRP的MSCs胞浆中有CGRP的分泌，均明显高于对照组(P<0.01)。同时，通过MTT、β-半乳糖苷酶染色和诱导分化分别检测转染后的MSCs，结果显示MSCs增殖、衰老及分化未受影响。
第二部分：划痕实验结果显示：MSCs-CGRP组中VSMCs迁移能力明显低于MSCs-EGFP组、MSCs组和对照组(P<0.05)，而后三组间比较无差异(P>0.05)。胎盘蓝染色示各组细胞存活率均大于90％，细胞数也少于其他各组(P<0.05)。细胞周期检查发现：MSCs-CGRP组较其余三组处于G0/G1期的细胞更多、S期更少(P<0.05)；FCM检测示：MSCs-CGRP组中VSMCs的早晚期凋亡数较其它组更高(P<0.05)，其余三组间比较无差异(P>0.05)；Western blot检测MSCs-CGRP组的α-SM-action蛋白较其余各组表达增加(P<0.05)，而OPN蛋白表达较其余各组表达减少(P<0.05)。
第三部分：MSCs-CGRP组和MSCs组颈动脉球囊损伤的内膜在各时间点均有EGFP标记的MSCs归巢，且部分同时表达CD31，对照组则无；细胞移植后28d行Westernblot检测：各组血管组织均有CGRP基因表达，MSCs-CGRP移植组较MSCs移植组和对照组表达明显增加(P<0.05)，后两组间比较无差异(P>0.05)。HE染色见对照组内膜增生最明显，同时间点细胞移植组新生内膜/中膜面积均低于对照组，其中MSCs-CGRP移植组较明显(P<0.05)；同时还观察到PCNA的表达在对照组最高，MSCs移植组次之，MSCs-CGRP移植组最低(P<0.05)：VSMCs表型改变Western blot检测结果显示：MSCs-CGRP组SM-α-action蛋白较MSCs组和对照组表达增加，但低于正常组(P<0.05)，MSCs-CGRP移植组的OPN表达较MSCs移植组和对照组减少，但多于正常组(P<0.05)。
结论:
第一部分：慢病毒载体可成功转染大鼠MSCs并使其CGRP基因表达增高，转染后MSCs胞浆有CGRP蛋白分泌至上清，转染后的MSC生物学特性未受影响。提示，MSCs是一种理想的基因载体细胞，可作为CGRP基因转染的靶细胞用于基因治疗。
第二部分：体外实验证实，CGRP基因修饰的MSCs能抑制VSMCs的增殖、迁移和促进凋亡，并能促进VSMCs的表型从合成表型向收缩表型转化，此结果为体内基因治疗奠定了理论基础。
第三部分：在大鼠体内，CGRP基因修饰的MSCs较单纯MSCs移植在促进动脉球囊损伤血管内皮修复同时，还表现出抑制VSMCs增殖和迁移，并一定程度上促进VSMCs表型的改变(从合成分型向收缩表型转化)。提示基因修饰后的干细胞移植治疗可有效地抑制内膜增生，从而更进一步降低血管成形术后再狭窄的发生。