【摘 要】
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鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer,RA）是属于黄杆菌科,拟杆菌门的一种革兰氏阴性菌,是引起鸭传染性浆膜炎的主要病原。在自然界中,已经发现有很多细菌能够发生自然转化,但对鸭疫里默氏杆菌是否能够发生自然转化还没有研究。本研究首次发现鸭疫里默氏杆菌能够发生自然转化,并在此基础上建立了一种新的基因缺失方法。主要试验结果如下:1.鸭疫里默氏杆菌自然转化现象的发现用GCB液体培
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鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer,RA）是属于黄杆菌科,拟杆菌门的一种革兰氏阴性菌,是引起鸭传染性浆膜炎的主要病原。在自然界中,已经发现有很多细菌能够发生自然转化,但对鸭疫里默氏杆菌是否能够发生自然转化还没有研究。本研究首次发现鸭疫里默氏杆菌能够发生自然转化,并在此基础上建立了一种新的基因缺失方法。主要试验结果如下:1.鸭疫里默氏杆菌自然转化现象的发现用GCB液体培养基将RA ATCC 11845株（对红霉素敏感）培养至至对数期;取300μL菌液(OD600=1)与1μg带有红霉素抗性基因（erm R）的RA CH-1基因组DNA进行孵育。将菌液涂至含有红霉素抗性的平板上发现,RA ATCC 11845获得了对红霉素的耐药性。通过PCR检测发现,erm R抗性基因成功插入到了RA ATCC 11845基因组上,表明RA ATCC 11845具有发生自然转化的能力。2.一种简便快速的鸭疫里默氏杆菌基因缺失方法的建立选取RA ATCC 11845 RA0C＿1193为待缺基因,分别扩增其上下游基因片段并通过融合PCR的方式按顺序与红霉素抗性基因erm R融合（RA0C＿1193 up-erm R-RA0C＿1193 down）。RA ATCC 11845与融合片段发生自然转化后,涂布在红霉素抗性平板上。对抗性单克隆PCR鉴定发现,erm R抗性基因能够替代RA0C＿1193目的基因,该方法同样可以用于RA CH-1的基因缺失;当转化DNA的量为0.1 ng到1μg时,转化效率随着DNA浓度的增加而增高;DNA为1μg时,转化效率达到饱和;随着同源臂长度的减少,转化效率也随之降低。30 min之内,随着孵育时间的延长,转化效率随之升高,1 min之内发生自然转化,20 min达到饱和。3.鸭疫里默氏杆菌优先识别自身DNA将融合片段与大肠杆菌XL1-blue基因组DNA或RA ATCC 11845基因组DNA混匀后,分别与RA ATCC 11845做自然转化。结果发现,相对于融合片段与大肠杆菌基因组DNA混匀组,融合片段与RA ATCC 11845基因组DNA混匀组转化效率显著降低。表明RA ATCC 11845基因组能够与融合片段发生竞争。除基因组DNA、片段DNA外,鸭疫里默氏杆菌还能摄取质粒DNA。
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