帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是以黑质多巴胺神经元变性为特征的疾病，细胞移植是有前景的治疗方法。寻找合适的供体细胞是PD细胞移植的关键问题之一。虹膜色素上皮细胞(iris pigment epithelium，IPE)在解剖结构上和睫状体上皮细胞等相连，为单层上皮细胞，其下可见基底膜，可与基质分离。近年来发现体外培养的IPE含有多种生长因子，如碱性成纤维细胞生长因子，胶质源性神经生长因子，脑源性神经生长因子，色素上皮生长因子等。这些生长因子对于保护神经细胞、促进细胞的生长和发育有一定作用。虽然目前未见IPE细胞分泌多巴胺的报道，但是IPE细胞胞浆中含有黑色素颗粒，考虑到多巴胺和黑色素的产生有着共同的通路，所以我们检测了体外培养的IPE细胞，我们发现IPE细胞可以分泌多巴胺和多种神经营养因子，并可以结合铁离子，所以我们认为IPE细胞可以作为帕金森病移植治疗的细胞来源。免疫排斥是细胞移植的难题，海藻酸钠—多聚赖氨酸是一种生物相容性良好的半透膜材料，用它来包裹移植物可以很好起到免疫隔离的作用。本实验旨在：1．详细研究猪IPE细胞体外多巴胺及神经营养因子的分泌特性。观察失去光线刺激的外环境是否会影响其功能，为其下一步的移植奠定基础。2．将该细胞用海藻酸钠—多聚赖氨酸包裹制作成微囊后，观察微囊包裹对细胞活性和其分泌特性的影响。3．将微囊包裹后的IPE细胞立体定向植入PD大鼠模型的纹状体，观察移植后疗效。第一部分猪IPE细胞的体外原代培养及鉴定目的：建立稳定的猪IPE细胞原代培养、纯化及鉴定方法。方法：酶消化法获取猪IPE细胞，纯化及传代后，观察细胞形态及生长状况；绘制细胞生长曲线；免疫细胞化学方法鉴定细胞：细胞角蛋白(cytokeratin)和S—100的表达，统计阳性细胞数，分别计算原代和传代后阳性细胞率。结果：细胞胞浆内含有大量黑色素颗粒；细胞经纯化、传代后，cytokeratin和S—100表达阳性率均较原代提高，P＜0.05；细胞生长曲线显示：传代后第2～3天为指数生长期，3天以后为平台期。第二部分猪IPE细胞体外生物学特性研究目的：观察猪IPE细胞体外DA、神经营养因子的分泌特性和铁结合能力，以及失去光照的环境是否对IPE细胞功能产生影响。方法：收集第1、2、3、4、5、6代IPE细胞传代后48h的培养上清液，高效液相色谱—电化学法(HPLC)检测样品中的DA含量；第2代IPE细胞分为正常培养组、光照组和遮光组，收集各组传代后第4，8，12，24，36，48，60，72h的培养上清液，HPLC法测定DA含量；ELISA法检测BDNF、GDNF、NT-3和NGF的分泌量；并测定IPE细胞结合铁的能力。免疫细胞化学法检测IPE细胞中TH的表达；RT-PCR方法检测该细胞中TH mRNA的表达。结果：第2代IPE细胞在传代后4h开始检测到多巴胺的分泌，分泌量在48h达高峰，以后缓慢下降并趋稳定；GDNF、BDNF、NT-3和NGF的分泌以及铁结合力较为恒定，随着培养时间的延长，并没有明显变化。传代后各代IPE细胞DA分泌量无显著区别；光照组的DA分泌在前16小时和其他两组无差别，16小时后的DA分泌明显高于其他两组(P＜0.05)。HVA、GDNF、BDNF、NGF和NT-3的分泌在各组之间没有明显差别(P＞0.05)。遮光组的铁结合力似乎低于其他两组，但是没有统计学意义。免疫细胞化学法检测到IPE细胞中有TH的表达；RT-PCR方法检测到IPE细胞内有TH mRNA的表达。第三部分海藻酸钠微囊的制作及微囊对IPE细胞生物活性的影响目的：优化适合IPE细胞的微囊制作条件。观察微囊化对细胞分裂以及DA、神经营养因子分泌情况的影响。方法：应用高压静电式微囊成型装置制备海藻酸钠-多聚赖氨酸微囊化细胞，摸索最适合的制备参数；显微镜下观察微囊的形态，并测量微囊的直径，用移植所用的针头来回抽吸微囊观察其强度；显微镜下观察囊内细胞的生长状况，并在第0、3、6、9、12天破囊后进行细胞计数并用台盼兰染色法检测囊内细胞存活率；将微囊化和非微囊化两组细胞在接种后第1～6天收集培养上清液，检测其中DA、HVA、BDNF、GDNF、NGF以及NT-3的量，观察微囊包裹对其分泌特性的影响，并检测铁结合力。结果：制备微囊的最佳参数为：室温18～20℃，内层海藻酸钠浓度为2.4％，外层海藻酸钠浓度为0.24％，液面高度为22～25mm，成囊电压为3.28kv；微囊形态接近正圆，表面光滑，大小均一，直径为：275±23μm。微囊经针头抽吸后未见破损；微囊内细胞的总数没有明显变化；细胞微囊化后培养60h内，微囊组的DA分泌与非微囊组相比明显增加；60h以后，二者无显著差异。微囊内细胞HVA、BDNF、GDNF、NGF、NT-3的分泌量与非微囊组细胞相比无显著差异。铁结合力二组之间没有显著性差别。第四部分PD大鼠模型的建立及IPE细胞的移植目的：建立稳定的6-OHDA毁损的偏侧PD大鼠模型，确立可靠的行为学评价指标。观察微囊化IPE细胞移植到模型大鼠纹状体的疗效。方法：1．模型的制备及鉴定：6—OHDA毁损内侧前脑束(medial forebrain bundle, MFB)建立PD大鼠模型，通过旋转试验、组织病理证实，并评价其它行为学指标是否有效。2．移植分组：分为IPE细胞+微囊组；空微囊组；单纯手术损伤组，进行右侧纹状体两点立体定向移植，分别植入2×10~4个IPE细胞、约280个含细胞的微囊，相应的对照组注射等量的生理盐水和空微囊。3．移植后的检测：观察移植后大鼠旋转行为以及其他行为学指标的变化；HPLC法测定各组纹状体区DA和HVA的含量。移植后第12周，取大鼠脑进行TH的免疫组化染色。提取移植区周围组织的蛋白，电泳后观察移植物是否影响移植区周围脑组织的蛋白合成。结果：1．大鼠模型经旋转试验、组织病理鉴定模型成功。2．行为学指标：调整步态、启动时间、单足运动的步距和速度是有效的行为学指标，自由运动的步距和速度不适合作为PD大鼠模型的行为学评价指标。3．移植后IPE+微囊组：33％的大鼠(10只)旋转行为在移植后第1周开始逐渐改善，至第4周改善更加明显(与其他组相比，P＜0.05)，几乎不旋转，一直持续到本试验结束(第12周)。二次移植治疗的大鼠从第二次治疗的时间开始计算，仍有20％的大鼠(4只)有效。总的计算，有约47％的大鼠(14只)治疗有效。这些出现疗效的大鼠的调整步态、启动时间、单足运动的步距和速度均明显改善。其他两组移植后行为学无明显改善。各组移植后纹状体DA含量的变化同其行为学改善相符合。4．组织免疫化学发现大部分微囊形态不规则，囊壁皱缩，但囊壁完整、未见破损。微囊内可见散在的圆形细胞。行为学得到改善的大鼠纹状体TH染色显示囊内细胞呈阳性，微囊周边的纹状体可见TH阳性纤维密度较空微囊组和单纯损伤组明显增高。5．移植区周围组织的蛋白和对侧相比没有明显差别。6．IPE+微囊组中有1只大鼠移植后2周左右出现严重的扭转痉挛，解剖后发现形成肿瘤样组织。结论1．猪IPE细胞取材方便，易于分离、纯化，体外生长、增殖活跃。机械-酶消化法获得的细胞经免疫细胞化学鉴定证实为IPE细胞，传代后细胞纯度提高。2．猪IPE细胞体外基础状态下即能分泌少量DA、GDNF、BDNF、NT-3和NGF，并具有结合铁的能力。这些功能不受传代的影响。光照会使DA分泌增加，其它功能不受影响。IPE细胞中还检测到TH mRNA及蛋白的表达。3．用高压静电微囊成型装置制备的APA微囊形态、大小、均匀度及强度均十分理想。微囊内的细胞不增殖。IPE细胞的DA、GDNF、BDNF、NT-3和NGF的分泌以及结合铁的能力不受微囊包裹影响。4．6—OHDA毁损MFB建立偏侧大鼠模型的成模率高。调整步态、起动时间、单足运动的步距和速度是有效的行为学评价指标。5．微囊化猪IPE细胞的纹状体移植对PD大鼠模型有治疗作用。疗效均持续至移植后12周。移植物对移植区周围脑组织的蛋白合成不造成明显影响。有1只大鼠移植区出现肿瘤。