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随着RNA干扰(RNA interference，RNAi)现象的发现和RNAi技术的广泛应用，具有调控功能的小RNA(regulatory small RNA)很快成为了研究的焦点。目前已经在植物和动物中鉴定到多种不同类型的调控小RNA，并且初步揭示了它们的生理功能和作用原理。这些19-31 nt的非编码RNA以序列特异性的方式使得mRNA降解、翻译抑制、异染色质形成和转座子控制，进而导致基因沉默。小RNA在细胞的生长、发育和分化等重要生理过程发挥了重要的调控作用。然而小RNA信号通路中尚有若干重要细节有待阐明，而且关于其自身的调控机制更是知之甚少。Hong等人发现esiRNA进入细胞后会诱导小鼠eri-1(meri-1)基因转录上调，导致RNA干扰效率降低。为了更深入理解哺乳动物细胞对高剂量esiRNA的生理反应，本文对meri-1基因转录水平的调控机制进行了初步研究。考察了CHO细胞转染高剂量esiRNA后Ⅰ型干扰素的分泌情况和meri-1基因启动子对γ干扰素(IFN-γ)的应答能力。初步探讨了细胞内RNA受体解旋酶RIG-Ⅰ与RNAi的关系。
在第一部分工作中，我们分别以绿色荧光蛋白GFP和分泌型碱性磷酸酯酶SEAP为报告基因，考察了meri-1基因启动子不同缺失突变对高剂量esiRNA的响应能力，并且确定出meri-1基因启动子中高剂量esiRNA的顺式响应元件。实验结果显示高剂量esiRNA诱导meri-1基因转录上调涉及meri-1基因启动子近端区域内两个顺式元件，分别为转录起始位点上游-84位至-77位的核心序列A(5’-CCCGCCCA-3’)和-47位至-30位的核心序列B(5’-CGCTCCCGGAAGTAGGAG-3’)。
在第二部分工作中，我们利用生物化学和细胞生物学的实验方法确定出高剂量esiRNA上调meri-1基因转录的反式作用因子。EMSA和寡聚核苷酸共沉淀结果显示Sp1和Ets-1分别能与端启动子中的核心序列A和核心序列B结合，并且共沉淀实验还表明只有高剂量esiRNA诱导后Sp1才能结合于meri-1基因的启动子与Ets-1形成复合物。借助RNAi技术下调Sp1和Ets-1的表达会导致启动子的转录活性明显降低。过表达Sp1和Ets-1的Dominant Negative突变同样会导致启动子转录活性明显减弱。综和上述结果可以确定高剂量esiRNA能够活化Sp1与Ets-1形成复合物上调meri-1基因的转录。
在第三部分工作中，我们首先考察了高剂量esiRNA与低剂量esiRNA诱导细胞分泌IFN-γ的差异，以及meri-1基因近端启动子对IFN-γ的应答能力。随后考察了细胞内RNA受体解旋酶RIG-Ⅰ过表达和表达下调对高剂量esiRNA诱导meri-1基因转录上调的影响以及对RNAi效率的影响。结果发现，IFN-γ的分泌与esiRNA的诱导之间存在剂量效应，并且meri-1基因近端启动子对IFN-γ有应答能力，由此推测高剂量esiRNA上调meri-1基因转录可能与其引起免疫反应有关，但是RIG-Ⅰ并未参与介导这一过程。相反，RIG-Ⅰ过表达会使esiHBVP下调HBsAg的效率提高。RIG-Ⅰ表达的下调会使esiHBVP沉默HBsAg的效率降低。过表达RIG-Ⅰ的解旋酶结构域更是会促进RNAi的效率，因此推测RIG-Ⅰ可能与RNAi通路的某些环节相关。
综上所述，我们的实验结果为RNAi调控机制的研究补充了有益的数据，为以后RNAi的应用研究提供了重要的基础信息。