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目的近年来的研究表明,环状RNA（circular RNA,circRNA）与肿瘤的发生、发展密切相关,参与了肿瘤细胞的增殖、凋亡、浸润和转移等多个过程;同时,circRNA良好的稳定性赋予了其作为肿瘤标志物的明显优势。胃癌一直以来在我国甚至东亚等国的发病率居高不下,虽然早期治疗的预后良好,但早期诊断率却一直较低,因此急需找到一种非创、敏感、特异的分子标志物。因此本论文以胃癌作为研究对象,采用分子生物学实验技术结合生物信息学分析手段,在组织、血浆和细胞3个层面揭示胃癌相关circRNA的表达谱,通过建立基于荧光染料法逆转录-微滴式数字聚合酶链反应（reverse transcription-droplet digital polymerase chain reaction,RT-ddPCR）技术对胃癌相关circRNA进行鉴定,最后探究circRNA作为胃癌分子标志物的临床诊断价值。方法1.先利用circRNA表达芯片,分别获得circRNA在胃癌组织和血浆中的表达谱;再通过TargetScan和miRanda软件预测circRNA与微小RNA（mircroRNA,miRNA）的结合关系,绘制出circRNA-miRNA互作图;最后对组织和血浆表达谱进行交集分析,筛选出作为胃癌标志物的候选circRNA。2.收集121例胃癌患者手术前和术后第10天的空腹血浆、手术中切除的癌组织及其相对应的正常胃黏膜组织、36例通过内镜黏膜下剥离术（endoscopic submucosal dissection,ESD）剥除的异型增生组织及其对应的正常胃黏膜组织;另收集121位健康人空腹血浆作为正常对照。3.建立基于荧光染料法的RT-dd PCR多重RNA检测方法,优化反应条件;同时比较实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应（quantitive reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR）和RT-ddPCR技术的优缺点,分析两者在检测circRNA时的准确性和重复性。4.采用qRT-PCR检测胃癌组织和胃癌细胞株中的2种代表性circRNA（hsacirc0001017和hsacirc0061276）的表达水平;采用基于染料法的RT-ddPCR检测胃癌患者和正常人血浆中circRNA的拷贝数。5.分析胃癌组织和患者血浆中circRNA表达趋势之间的关系,探究血浆circRNA的来源,并利用细胞上清实验进行验证。分别分析胃癌细胞中circRNA与其宿主基因的表达水平。6.分析circRNA水平与胃癌患者临床病理因素之间的相关性;建立联合受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线分析hsacirc0001017和hsacirc0061276的联合诊断效率;利用生存分析和Cox回归模型评估组织和血浆中circRNA对患者术后总体生存期（overall survival,OS）和无病生存期（disease-free survival,DFS）的预测效率。7.构建circRNA过表达载体,检测细胞中circRNA的上调情况,为研究circ RNA导致胃癌发生的机制奠定基础。结果1.通过分析胃癌相关circRNA表达谱,我们发现了343种circRNA在胃癌患者和正常人血浆之间表达差异倍数大于2倍,其中高表达和低表达的分别有171种和172种;而在胃癌组织和正常组织之间表达差异倍数大于2倍的circRNA有308种,其中高表达和低表达者分别为107种和201种。通过交集分析,筛选出17种在胃癌组织和血浆水平同步变化的circRNA（3种高表达,14种低表达）。2.建立了在单孔内使用EvaGreen染料对3种RNA同时定量检测的新方法;发现对组织和血浆circRNA进行定量时,绝对定量RT-ddPCR方法具有较高的稳定性和精确性。3.Hsacirc0001017和hsacirc0061276在胃癌细胞、胃癌组织中均呈现低表达,其中hsacirc0001017在异型增生组织中的表达水平低于胃癌组织;hsacirc0001017和hsacirc0061276在胃癌患者血浆中低表达,并在术后10天恢复至正常水平。4.Hsacirc0001017和hsacirc0061276与胃癌患者的主要临床病理因素密切相关。5.细胞培养实验证明,胃癌细胞可分泌circRNA。6.血浆hsacirc0001017和hsacirc0061276的ROC曲线下面积（area under curve,AUC）分别达到0.851和0.849。联合上述4种circRNA能大大提高胃癌的诊断效率,其AUC达到0.966,特异度和灵敏度分别为0.955和0.957（对应的阴性诊断率和阳性诊断率分别为95.5%和95.7%）。其中,联合血浆hsacirc0001017和hsacirc006127的AUC为0.912,特异性和灵敏度分别达0.847和0.966。在早期诊断中,组织hsacirc0001017的AUC为0.871,特异性和敏感度分别达到0.794和0.811。7.胃癌患者血浆hsacirc0001017或hsacirc0061276水平可反映OS;术后血浆hsacirc0001017或hsacirc0061276回复组的DFS较长。经TNM分期发现,血浆hsacirc0001017或hsacirc0061276的水平也可提示其OS和DFS。血浆hsacirc0001017的术前水平和术后回复情况皆可作为患者生存期的独立预测因子。8.成功建立有效的circRNA过表达质粒,为研究circRNA在胃癌发生中的作用奠定了基础。结论本研究是第一个较为系统地探讨胃癌组织和胃癌患者血浆中circRNA表达谱的研究。进一步通过对2种代表性circ RNA（hsacirc0001017和hsacirc0061276）在血浆、组织和细胞3个层面的表达水平的研究,我们发现这2种cir RNA在胃癌组织和患者血浆中均为低表达,而术后其在血浆水平中回复正常。结果表明,组织hsacirc0001017可作为胃癌早期诊断的标志物,联合血浆hsacirc0001017和hsacirc0061276可作为胃癌非创性诊断标志物并且是独立的预后预测因子,为胃癌诊治提供了新思路。成功建立了基于染料法RT-ddPCR的多重RNA检测方法,为血浆circRNA的检测提供了高效、经济、简便的新技术。