研究背景及目的卵巢早衰（Premature Ovarian Failure,POF）,也称原发性卵巢功能不全（primary ovarian insufficiency,POI）,是一种高度异质性疾病,影响着0.5-3.0%的育龄期女性。未经治疗的卵巢早衰患者发生骨质疏松,心血管疾病,认知能力下降和帕金森等疾病的风险成倍增加,严重损害女性生殖健康和生活质量^[1]。因此,卵巢早衰的防治受到越来越多学者的关注。所有形式的卵巢衰老（Premature ovarian senescence,POS）多经历了隐匿期,生化期和终末期。早期都是无症状的过程,发现时其卵巢功能完全丧失,且几乎无治疗方法^[2]。卵巢早衰的病因和发病机制尚不完全清楚,已知的病因包括:遗传,感染,环境,免疫,化疗,放疗和手术等。9%-40%的卵巢早衰患者合并有其他自身免疫性疾病,如原发性肾上腺皮质功能不全（Addison’s病）或自身免疫性甲状腺疾病（Grave’s或Hashimoto病）,因此推动了对POF自身免疫病因的研究。近年来许多研究者提出自身免疫性卵巢疾病（Autoimmune ovarian disease,AOD）可能是POF发病的免疫学机制^[3-5]。前期研究证实早期过继回输正常小鼠的Treg（Regulatory T cells）细胞可有效预防D3tx（thymectomizeon day3）小鼠自身免疫性卵巢疾病的发生,提示Treg细胞的异常/耗竭在自身免疫性卵巢疾病发生发展中具有关键的作用^[6,7]。研究同时观察到在回输前的D3tx小鼠卵巢组织中可见大量浸润的T细胞和B细胞,而回输后未见,推测Treg细胞的功能紊乱与体液免疫/B细胞的后续效应性变化密切相关^[8]。这样的调节作用是Treg细胞通过直接抑制和调节效应T细胞功能维持自身耐受性和免疫稳态?还是Treg细胞直接抑制和调节B细胞功能?为回答这一问题,本研究检测了自身免疫性卵巢疾病小鼠模型中Treg细胞和B细胞的时相性变化,初步探索Treg调节B细胞功能的作用机制,以期为卵巢早衰早期免疫学改变提供新线索,进而提出POF/POI治疗的新方法。研究方法通过摘除新生第3天BALB/c小鼠胸腺,建立AOD小鼠动物模型（D3tx组/实验组）;定期采集外周血、卵巢、脾脏及盆腔淋巴结组织等,分别用于ELISA检测性激素及辅助T细胞相关炎症因子,HE染色观察卵巢组织形态学改变;流式细胞学检测脾脏与盆腔淋巴结中CD4⁺T细胞、Treg细胞以及B细胞亚群（活化B细胞、浆细胞）的动态变化;Treg细胞（nTreg、iTreg）与B细胞体外共培养后,检测B细胞增殖（CSFE）改变,并在iTreg细胞与B细胞共培养时,分别加入Transwell小室、TGF-β抑制剂、IL-10抑制剂,检测B细胞增殖改变,以及iTreg细胞对B细胞凋亡（Annexin-V/FITC）的影响;为探索AOD治疗窗口期,本研究还运用磁珠分选法分离正常小鼠脾脏中CD4⁺CD25⁺Treg（nTreg）和NaiveCD4⁺T细胞,NaiveCD4⁺T细胞经体外TGF-β刺激后得到iTreg细胞,分别将nTreg、iTreg经腹腔过继回输至术后1周和8周实验组小鼠,并于回输前后对卵巢组织中病理学改变进行AOD评分^[8]。研究结果1、ELISA检测术后每周小鼠外周血中性激素（E2、FSH、LH）的浓度改变,结果显示术后5¹0周,实验组E2均数明显低于对照组,而FSH及LH均数明显高于对照组。2、HE及免疫组化染色后观察两组小鼠卵巢组织,结果显示:实验组小鼠在术后第3周卵巢间质中可见少许CD19⁺淋巴细胞浸润,术后第5周卵巢间质中见大量CD3⁺、CD19⁺淋巴细胞浸润,纤维组织增生,生长卵泡数目明显减少,闭锁卵泡数目明显增多。术后5周AOD表现达到2³级,随时间推移,逐渐加重,到第8周时已达4级。3、ELISA检测术后每周小鼠外周血中辅助T细胞炎症因子表达,结果显示:与对照组比较,实验组术后5¹0周外周血TGF-β和IL-4明显降低,IFN-r和IL-21明显升高。4、流式细胞学检测分析术后1¹0周、每周小鼠脾脏及盆腔淋巴结中CD4⁺T细胞、Treg细胞以及B细胞亚群的动态变化,结果显示:与对照组相比,实验组CD4⁺T细胞术后1¹0周轻度升高;Treg细胞术后1³周轻微升高,3周后逐渐下降,5¹0周持续低于对照组;术后1周（CD138^-IgD⁺）活化B细胞开始逐渐升高,并持续到第10周;（CD138⁺CD19^-IgD^-）浆细胞在术后1⁴周无明显变化,术后5周起逐渐升高。5、采用Pearson统计方法分析脾脏及盆腔区域淋巴结中Treg和B细胞亚群动态变化的相关性,结果显示:术后5¹0周实验组脾脏及盆腔区域淋巴结中Treg与浆细胞（CD138⁺CD19^-IgD^-）间无相关性（r=-0.1457,P=0.05640）,而Treg与活化B细胞（CD138^-IgD⁺）呈负相关性（r=-0.6622,P=0.0028）。6、磁珠分选小鼠脾脏nTreg细胞、na?ve CD4⁺T细胞,流式细胞学检测细胞纯度分别为96.1%、97.5%,TGF-β体外刺激na?ve CD4⁺T细胞生成iTreg细胞,细胞纯度为83.2%,流式细胞术分选B细胞,纯度为96.8%。7、将对照组B细胞以及实验组B+nTreg、B+iTreg细胞体外培养72小时后,CFSE方法检测B细胞增殖,结果显示:与对照组比较,实验组两组的B细胞增殖均显著降低,而实验组两组间无统计学差异。8、在B细胞与iTreg细胞共培养体系中,（1）间接接触培养,加入Transwell小室,分别将B细胞加入上室,iTreg细胞加入下室;（2）直接接触培养,分别加入TGF-β抑制剂、IL-10抑制剂;72h后流式细胞术检测B细胞增殖情况,结果显示:与对照组比较,分别加入Transwell小室、TGF-β抑制剂、IL-10抑制剂三组的B细胞增殖均显著增加。9、将对照组B细胞以及实验组B+iTreg细胞体外培养16小时后,Annexin-V/FITC方法检测B细胞凋亡,结果显示:两组B细胞的凋亡无统计学差异。10、实验组术后1周及8周分别回输nTreg、iTreg,比较回输前后卵巢组织病理学变化及AOD评分,结果显示:术后1周回输iTreg和nTreg均可以有效预防AOD的发生,术后8周回输iTreg和nTreg并不能有效缓解AOD的发生。结论胸腺摘除的D3tx小鼠产生了类似人类POF的典型表现,如炎性细胞对卵巢内卵泡及间质的浸润,包括淋巴细胞,浆细胞和单核巨噬细胞,致使卵巢结构紊乱,卵泡缺失,闭锁。小鼠自身免疫性卵巢疾病始发于细胞免疫功能损害（T细胞数量和功能异常）,后期卵巢中继发出现浆细胞、活化B细胞增多,并浸润于卵巢间质与卵泡,是研究免疫性卵巢早衰的良好模型。D3tx模型小鼠胸腺摘除后局部淋巴器官和组织中Treg细胞数量减损,经历了代偿性升高的短期保护性反应期,术后5周以后出现卵巢病理性改变,Treg细胞与活化B细胞呈负相关性,推测Treg细胞对B细胞的抑制作用起到了短期的保护性作用,而术后5周的Treg细胞数量减少和功能减损,导致B细胞的异常活跃,与后续的卵巢局部组织损害的发生密切相关。在后续的体外共培养体系中,验证了Treg细胞是通过细胞接触和分泌细胞因子途径来抑制B细胞增殖的。卵巢组织病理损害发生前,过继回输nTreg及iTreg细胞均能有效抑制AOD的发生,而在病理损害发生以后过继回输两组Treg细胞,均不能有效改善AOD结局。提示临床免疫性POF的治疗也应存在一定的窗口期,早期诊断非常重要。