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目的考察湿热环境对RA模型DNA甲基化的影响及白虎加桂枝汤抗RA效果,揭示湿热痹的表观遗传学特征和基于炎症反应的白虎加桂枝汤抗RA表观遗传机理的初步探究。实验方法在人工气候箱条件下模拟在高温(37.5摄氏度)、高湿(70%-80%)环境下,考察佐剂性关节炎模型大鼠足肿胀度、病理、血清IL-6、TNF-α、RF、ACPA水平变化,评价高温高湿对其疾病模型特征的影响；在此基础上,为进一步探讨确定湿热环境对RA的表观遗传学特征,本课题在相同人工气候箱条件下,通过华大基因MeDIP-Seq测序方法,考察了正常大鼠、佐剂性关节炎大鼠与湿热环境下的佐剂性关节炎大鼠膝关节滑膜全基因组甲基化水平的改变,通过比对、go分析、passway分析等,确定湿热环境下RA DNA甲基化分子特征；最后,在表观遗传学指导下,通过确定湿热环境下RA不同DNA甲基化分子特征的炎症外在表达因子分析,进一步测定了湿热环境下佐剂性关节炎大鼠足肿胀、病理、血清因子(IL-6、TNF-α、IL-1β、 IL-12P70、MCP-1、IP-10、VEGF、EGF、IFNr、 IL-4、IL-17A)水平,从血清因子的角度初步验证了湿热痹经方白虎加桂枝汤治疗的抗炎作用及其机制。实验结果1.湿热环境对佐剂性关节炎模型大鼠关节病理及血清炎症相关因子的影响与空白对照组比较,CFA组足肿胀度、病理、血清IL-6、TNF-α、RF、ACPA水平升高,具有显著的统计学意义(P<0.05)：与CFA组比较,湿热CFA组血清IL-6、TNF-α、RF、ACPA水平显著升高(P<0.05),足肿胀度、病理虽无显著意义,但亦有加重趋势。2.湿热痹模型大鼠DNA甲基化特征研究与空白对照组比较,CFA组甲基化水平显著降低,有4485个差异甲基化基因,在17个通路显著富集(P<0.05),包括许多与免疫、生长与炎症反应相关的通路,如T细胞受体信号传导通路、B细胞受体信号转导通路、MAPK信号通路、Wnt信号通路、黏着与原发性免疫缺陷等,有52个在差异通路中显著表达的基因如Zap70、PAK7、Tab1、Pla2g6、Map3k14、Nfatc3、Fas等；湿热CFA组与CFA组相比,甲基化水平略高于CFA组但显著低于空白对照组,有2721个差异甲基化基因(1380个down基因和1341个up基因),在15个KEGG通路显著富集(P<0.05),其中8个共同的预测通路如钙信号传导途径、Wnt信号通路、粘着连接、血管平滑肌收缩、紧密连接、白细胞跨内皮迁移、趋化因子信号传导途径和MAPK信号通路,7种不同的预测通路如黏着、多巴胺突触、B细胞受体信号通路、转录误调节癌症、代谢途径、细胞粘附分子(CAMs)和NF-κB信号通路；有15个在KEGG通路中显著富集的基因,如Ssx2ip、Tjap1、Vwf、 Hgf、Colla1、Co16a3、Plcb4、Atp1b4、Csnk2a2、Mpdz、Epb4112、Ddx58、Ripk1、 Ifitm2和IKKα分别在炎症、凋亡、细胞增殖代谢等多种细胞通路中发挥作用。3启虎加桂枝汤对湿热痹症候动物模型炎性相关因子的影响与空白对照组比较,模型对照组大鼠足肿胀度、病理、血清促炎因子IL-6、 TNF-α、IL-1β和IL-12P70,趋化因子MCP-1、IP-10和生长因子VEGF水平显著升高(P<0.05)；与模型对照组比较,白虎加桂枝汤高、中、低剂量显著改善热痹症候大鼠足肿胀度、病理、血清促炎因子IL-6、TNF-α、EL-1β和IL-12P70,趋化因子MCP-1、IP-10和生长因子VEGF水平(P<0.05)。三组IL-4、IL-17A、 IFNr、EGF未检测到。结论1.本实验条件下,通过对CFA模型大鼠与湿热CFA模型大鼠足肿胀度、血清因子、踝关节病理形态学的对比研究,我们发现湿热环境可以明显加重RA疾病模型关节滑膜的病理改变,提高血清炎症相关因子IL-6、TNF-α、RF和ACPA水平,提示湿热环境因素在在RA发病中具有重要的作用。2.通过对湿热环境下佐剂性关节炎大鼠足肿胀度、病理、血清IL-6、RF、 ACPA水平及DNA甲基化的分析,在本实验条件下,我们发现湿热环境可以影响RA的疾病状态且具有与疾病模型不同的表观遗传特征。具体表现为整体CpG岛甲基化水平较低,有1380条down基因与1341条up差异基因表达,这些基因功能表现为生物粘附、免疫系统进程、细胞过程、细胞增殖与杀伤等27个生物进程,并在钙信号传导途径、Wnt信号通路、粘着连接、血管平滑肌收缩、紧密连接、白细胞跨内皮迁移、趋化因子信号传导通路、MAPK信号通路、黏着、B细胞受体信号通路、多巴胺突触、转录误调节癌症、代谢途径、细胞粘附分子(CAMs)和NF-κB信号通路中显著表达,且后7种信号通路特异性表达,最终筛选出Ssx2ip、Tjap1、Vwf、Hgf、Colla1、Co16a3、Plcb4、Atp1b4、Csnk2a2、 Mpdz、Epb4112、Ddx58、Ripk1、Ifitm2和IKKα这15个湿热环境下RA证候模型大鼠特征表达基因。3.通过白虎加桂枝汤对热痹症候动物模型足肿胀度、病理、血清促炎因子IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-12P70、趋化因子MCP-1、IP-10和生长因子VEGF水平的改善情况,在本实验条件下,白虎加桂枝汤具有良好的抗炎作用,其可能通过拮抗炎症介质、抑制血管翳的形成等达到抗炎的作用,也从侧面显示白虎加桂枝汤对NF-κB、B细胞受体信号通路和趋化因子信号传导通路等信号通路中下游表达因子的改善,更进一步说明白虎加桂枝汤可能通过影响湿热痹模型DNA甲基化而达到改善RA的效果。