高附加值化合物D-柠檬烯是一种天然的单萜类化合物，因其具有抑菌、抗癌等多种生理功能，被广泛地应用于食品和药品等行业中。在本实验室的前期工作中，通过代谢工程改造已经获得一株高产柠檬烯的解脂耶氏酵母工程菌。本课题将进一步对此工程菌进行分子改造并结合发酵过程优化，以期大幅提高D-柠檬烯的产量;此外，本课题还将基于绿色、可持续发展新理念，拓宽解脂耶氏酵母的碳源谱，使其具备利用木糖进行发酵生产柠檬烯的能力。　　前期的研究中，本实验室通过一系列改造构建了一株解脂耶氏酵母的D-柠檬烯生产菌株Po1f-LN-051，其在摇瓶上的产量为6.4mg/L。本课题首先在此菌株上再次过表达柠檬烯合成酶基因(tLS)，发现增加一个tLS基因拷贝数利于菌株Po1f-LN-053对D-柠檬烯的进一步合成，其摇瓶产量提升至14.9mg/L。随后，对工程菌株Po1f-LN-053进行摇瓶培养的部分条件优化。结果显示，选用30g/L的甘油为主碳源及添加4g/L的柠檬酸的情况下，D-柠檬烯产量可达到58.4mg/L。最后，通过摸索1.5L发酵罐的流加补料实验，使菌株Po1f-LN-053的最终产量为165.3mg/L，相较于出发菌株提升了约26倍，是目前发酵罐水平利用酵母异源合成D-柠檬烯的最高产量。　　其次，为了使解脂耶氏酵母具有利用木糖进行生长代谢的能力，通过整合型质粒在解脂耶氏酵母中导入了木糖代谢基因XYL1、XYL2、ylXKS和柠檬烯合成基因tLS、tNDPS1，得到的菌株LYBX03可以利用木糖进行D-柠檬烯生产。由于受限于质粒的基因整合能力与有限的营养筛选标记，无法对LYBX03进行进一步优化改造以提高菌株对柠檬烯的生产能力。为解决这一问题，利用针对解脂耶氏酵母新开发的分子工具CRISPR-Cas9系统将木糖代谢基因敲入到染色体中，同时导入柠檬烯合成途径表达载体p1312LLN和MVA途径优化载体p1269HMG1ERG12，所得菌株LYBX15能够较好地利用D-木糖上合成D-柠檬烯，其摇瓶产量约为9.1mg/L。