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背景:
肾母细胞瘤(WilmsTumor,WT)是儿童中常见的泌尿系统恶性肿瘤，发病率约为1/10000。肾母细胞瘤的恶性度高、生长较快，部分患者可合并有尿道下裂、隐睾、散发性无虹膜等畸形。目前治疗方案主要采用美国肾母细胞瘤研究组(National WilmsTumor Study Group，NWTS)和国际小儿肿瘤协会（International Society of Pediatric Oncology,SIOP）制定的治疗标准，根据分期、年龄、瘤重和组织病理分型，可给予个体化治疗。肾母细胞瘤患儿可通过手术扩大切除肿瘤，并且结合放化疗等综合治疗方法，可显著提高总生存率，有文献报道称在发展中国家的5年总存活率可达到80％以上。但手术扩大切除以及术后大剂量化疗的副作用逐渐被重视，可严重影响存活患儿的生活质量。因此前瞻性识别低复发率、低风险的患儿，寻找靶向分子治疗，降低患儿的治疗后的毒副作用，提高生存率，是儿外科医生面临的诸多问题。
肿瘤相关巨噬细胞(Tumor associated macrophages，TAMs)是肿瘤间质细胞的重要组成部分，是由骨髓抑制细胞、单核细胞在肿瘤部位募集、分化和增殖而形成。近年来的研究表明，TAMs在肿瘤中有着重要的作用，主要表现在促进其增殖、侵袭，促进免疫逃避、血管生成等方面。根据肿瘤微环境中不同细胞、趋化因子的影响，TAMs可分化为具有不同作用的亚型，可受LPS、IFN-γ等刺激后极化为具有抗肿瘤作用的M1型巨噬细胞，属于TAMs的经典活化途径;也可在IL-4、IL-10、IL-13等因子作用下极化为具有促肿瘤作用的M2型巨噬细胞，属于TAMs的替代活化途径。近年来大量的研究证实TAMs在肿瘤中的高表达与患者的不良预后有相关性，例如，在上皮性卵巢癌、胰腺癌、髓母细胞瘤、乳腺癌中TAMs的增多预示着不良的预后，但TAMs在肾母细胞瘤中的表达及作用尚未有明确研究，需进一步探讨。
由于肿瘤微环境对TAMs的影响，可使其极化为有不同作用的亚型，对肿瘤的作用有着两面性。在肿瘤发生初期肿瘤间质中TAMs主要向M1型巨噬细胞极化，随着肿瘤的不断进展，TAMs的极化方向调整为促肿瘤作用的M2型巨噬细胞，从而增强肿瘤的侵袭、转移能力。TAMs主要分布于肿瘤间质中，与肿瘤细胞相辅相成，TAMs表面高表达CSF-1受体，而肿瘤细胞可产生大量CSF-1，使TAMs向促肿瘤的亚型极化，而极化后的TAMs可分泌CCL2、EGF因子促进肿瘤细胞的增殖，可分泌PDGF、VEGF等因子促进肿瘤周围血管生成，分泌MMPs水解破坏基质膜促进肿瘤的迁移。近年来研究发现，虽然靶向抑制肿瘤细胞是肿瘤治疗的主要途径，但抗TAMs的治疗也成为了肿瘤治疗中重要的辅助手段。抗TAMs的治疗常规有两大途径，一是抑制单核细胞/TAMs在肿瘤部位的聚集;二是调控TAMs向具有抗肿瘤作用的类M1型巨噬细胞的亚型极化。依据TAMs表面抗原、激酶受体表达分布情况，特异性选择靶点，抑制TAMs的聚集、极化过程，达到调节肿瘤微环境、促进T细胞免疫的作用，为肿瘤的治疗提供新的切入点。
肾母细胞瘤中TAMs的分布、不同亚型的表达情况，尚无明确研究。因此，探讨TAMs在肾母细胞瘤表达情况及相关调控机制，有助于了解TAMs在肾母细胞瘤中的作用机制，并针对性的提出靶向TAMs的治疗方案，为研究肾母细胞瘤的发生发展机制、分子靶向治疗提供了新的思路。
目的:
探讨肾母细胞瘤中不同亚型的TAMs表达情况，与临床患者随访信息进行相关性分析;通过细胞实验研究TAMs促进肾母细胞瘤的相关分子机制，并对TAMs的极化过程进行初步的调控;应用超小型超顺磁氧化铁颗粒(Ultrasmall Superparamagntic lron Oxide，USPIO)作为药物载体，制作靶向纳米复合物精准调控TAMs的极化过程，抑制肾母细胞瘤的增殖、侵袭。
方法:
收集2006.04到2014.03在山东省立医院进行手术治疗的肾母细胞瘤患者信息，术前未行放化疗治疗，符合入组标准的共61人，其中男性44人，女性17人，中位年龄是19个月(2-106月)。根据NWTS-5分期标准，Ⅰ期27人，Ⅱ期18人，Ⅲ期16人。进行Western Blot、免疫组化、免疫荧光分别检测肿瘤与瘤旁组织中M1、M2型巨噬细胞表达情况，根据患者随访信息，制作Kaplan-Meier生存曲线，分析M1、M2型巨噬细胞表达与患者预后的相关性。
诱导THP-1分别极化为M1、M2型巨噬细胞，并应用PCR、Western Blot、免疫荧光等方法验证诱导结果。将M1、M2型巨噬细胞分别与肾母细胞瘤细胞SK-NEP-1共培养，通过CCK8、Transwell方法测定SK-NEP-1细胞活力、侵袭能力的改变，研究不同极化类型的TAMs对肾母细胞瘤的作用。应用PCR、Western Blot、ELISA从基因、蛋白角度研究M1、M2型巨噬细胞的差异表达MMP9蛋白，在肾母细胞瘤组织中应用Western Blot、免疫组化进一步分析MMP9的表达情况。对TAMs促肿瘤机制的相关信号通路，进行研究。研究M2型巨噬细胞极化过程中的重要信号通路STAT6作用机制，通过阻断该信号通路对肾母细胞瘤产生的影响。
应用碳二亚胺法将PEG修饰后的磁性纳米氧化铁颗粒USPIO分别与STAT6信号通路抑制剂AS1517499、CD163单克隆抗体耦联制作靶向纳米复合物AS1517499-USPIO-CD163(AUC)，测定靶向纳米复合物AUC的稳定性、水合粒径、铁浓度、AS1517499包封率载药率、CD163的抗体含量，透射电子显微镜观察靶向纳米复合物AUC的颗粒特点。应用Western Blot、免疫荧光法检测靶向纳米复合物AUC中AS1517499、CD163抗体的活性。通过AO/EB、流式细胞术测定AUC对M2型巨噬细胞凋靶向高选择性，并在TAMs与肾母细胞瘤共培养体系检测AUC的药物效果。
结果:
肿瘤相关巨噬细胞在肾母细胞瘤组织中高表达，表达量明显高于瘤旁正常组织，主要分布在肿瘤间质中。随临床分期增加，M2型巨噬细胞的数量逐渐增加，而M1型巨噬细胞数量逐渐降低，组间差异明显。通过Kaplan-Meier生存曲线分析，M1型巨噬细胞表达阳性的患者与表达阴性的患者的总生存率未见明显差异(p=0.074)，M2型巨噬细胞表达阳性的患者的总生存率明显低于表达为阴性的患者(p=0.011)。
THP-1细胞诱导为M1、M2型巨噬细胞成功，细胞表型鉴定可见M1型巨噬细胞中特异性蛋白CD80，iNos呈高表达，而M2型巨噬细胞中Arg-1，CD163，CD206表达较M1型巨噬细胞增多。将M1，M2型巨噬细胞分别与肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞共培养之后，通过CCK8，Transwell实验测定细胞的活力、侵袭能力变化，可以发现M2型巨噬细胞可提高肾母细胞瘤细胞的活力、侵袭能力。应用PCR、Western Blot、ELISA方法在基因、蛋白、细胞上清液角度测定两种亚型巨噬细胞中表达差异发现，MMP9在两者之间差异明显，且肾母细胞瘤组织中的MMP9也呈高表达。MMP9通过激活AKT/PI3K信号通路，降低E-Cadherin蛋白、增加N-Cadherin蛋白表达，启动上皮间充质转化(EMT)过程，明显增强SK-NEP-1细胞侵袭迁移能力。STAT6信号通路可以调控M2型巨噬细胞极化，应用抑制剂AS1517499后发现磷酸化的STAT6降低，M2型巨噬细胞特异性蛋白CD206，CD163的表达降低，在共培养体系中阻断STAT6信号通路可以明显减少M2型巨噬细胞极化，抑制肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞的增殖、侵袭。
通过碳二亚胺法将纳米级的PEG修饰USPIO先后与AS1517499、CD163单克隆抗体耦联成功，靶向纳米复合物AS1517499-USPIO-CD163具有AS1517499、USPIO、CD163抗体的三重活性，其水合粒径小于100nm，稳定性良好，每1mgFe中有AS1517499约145.9±36.9μg，CD163抗体34±8.9μg，透射电镜观察其形态呈圆形或椭圆形颗粒，形态规则，大小均一，呈聚团分布，铁核直径在5nm左右。
结论:
在肾母细胞瘤中TAMs集聚、表达量增加，M1型巨噬细胞随着临床分期进展逐渐减少，而M2型巨噬细胞与临床分期呈正相关。M2型巨噬细胞的数量增加预示着患者不良的预后。M2型巨噬细胞可促进肾母细胞瘤的增殖、侵袭迁移，其主要作用机制可能为，通过分泌MMP9蛋白激活AKT/PI3K信号通路启动上皮间充质转化(EMT)过程。STAT6信号通路在M2型巨噬细胞极化过程有重要作用，其信号通路抑制剂AS1517499可明显减少M2型巨噬细胞的生成，对肾母细胞瘤起到抑制作用，可作为肾母细胞瘤治疗的新靶点进行深入研究。
靶向纳米复合物AS1517499-USPIO-CD163可通过碳二亚胺法合成，水合粒径小，稳定性良好，其中包含的STAT6信号通路抑制剂AS1517499及CD163抗体活性良好，可用于分子靶向治疗。靶向纳米复合物AUC的核心为磁性纳米级氧化铁颗粒，可主动被巨噬细胞吞噬导致凋亡，对M2型巨噬细胞有靶向高选择性，可作为靶向抗TAMs的治疗药物，对肾母细胞瘤的增殖、侵袭有明显的抑制作用。
肾母细胞瘤(WilmsTumor,WT)是儿童中常见的泌尿系统恶性肿瘤，发病率约为1/10000。肾母细胞瘤的恶性度高、生长较快，部分患者可合并有尿道下裂、隐睾、散发性无虹膜等畸形。目前治疗方案主要采用美国肾母细胞瘤研究组(National WilmsTumor Study Group，NWTS)和国际小儿肿瘤协会（International Society of Pediatric Oncology,SIOP）制定的治疗标准，根据分期、年龄、瘤重和组织病理分型，可给予个体化治疗。肾母细胞瘤患儿可通过手术扩大切除肿瘤，并且结合放化疗等综合治疗方法，可显著提高总生存率，有文献报道称在发展中国家的5年总存活率可达到80％以上。但手术扩大切除以及术后大剂量化疗的副作用逐渐被重视，可严重影响存活患儿的生活质量。因此前瞻性识别低复发率、低风险的患儿，寻找靶向分子治疗，降低患儿的治疗后的毒副作用，提高生存率，是儿外科医生面临的诸多问题。
肿瘤相关巨噬细胞(Tumor associated macrophages，TAMs)是肿瘤间质细胞的重要组成部分，是由骨髓抑制细胞、单核细胞在肿瘤部位募集、分化和增殖而形成。近年来的研究表明，TAMs在肿瘤中有着重要的作用，主要表现在促进其增殖、侵袭，促进免疫逃避、血管生成等方面。根据肿瘤微环境中不同细胞、趋化因子的影响，TAMs可分化为具有不同作用的亚型，可受LPS、IFN-γ等刺激后极化为具有抗肿瘤作用的M1型巨噬细胞，属于TAMs的经典活化途径;也可在IL-4、IL-10、IL-13等因子作用下极化为具有促肿瘤作用的M2型巨噬细胞，属于TAMs的替代活化途径。近年来大量的研究证实TAMs在肿瘤中的高表达与患者的不良预后有相关性，例如，在上皮性卵巢癌、胰腺癌、髓母细胞瘤、乳腺癌中TAMs的增多预示着不良的预后，但TAMs在肾母细胞瘤中的表达及作用尚未有明确研究，需进一步探讨。
由于肿瘤微环境对TAMs的影响，可使其极化为有不同作用的亚型，对肿瘤的作用有着两面性。在肿瘤发生初期肿瘤间质中TAMs主要向M1型巨噬细胞极化，随着肿瘤的不断进展，TAMs的极化方向调整为促肿瘤作用的M2型巨噬细胞，从而增强肿瘤的侵袭、转移能力。TAMs主要分布于肿瘤间质中，与肿瘤细胞相辅相成，TAMs表面高表达CSF-1受体，而肿瘤细胞可产生大量CSF-1，使TAMs向促肿瘤的亚型极化，而极化后的TAMs可分泌CCL2、EGF因子促进肿瘤细胞的增殖，可分泌PDGF、VEGF等因子促进肿瘤周围血管生成，分泌MMPs水解破坏基质膜促进肿瘤的迁移。近年来研究发现，虽然靶向抑制肿瘤细胞是肿瘤治疗的主要途径，但抗TAMs的治疗也成为了肿瘤治疗中重要的辅助手段。抗TAMs的治疗常规有两大途径，一是抑制单核细胞/TAMs在肿瘤部位的聚集;二是调控TAMs向具有抗肿瘤作用的类M1型巨噬细胞的亚型极化。依据TAMs表面抗原、激酶受体表达分布情况，特异性选择靶点，抑制TAMs的聚集、极化过程，达到调节肿瘤微环境、促进T细胞免疫的作用，为肿瘤的治疗提供新的切入点。
肾母细胞瘤中TAMs的分布、不同亚型的表达情况，尚无明确研究。因此，探讨TAMs在肾母细胞瘤表达情况及相关调控机制，有助于了解TAMs在肾母细胞瘤中的作用机制，并针对性的提出靶向TAMs的治疗方案，为研究肾母细胞瘤的发生发展机制、分子靶向治疗提供了新的思路。
目的:
探讨肾母细胞瘤中不同亚型的TAMs表达情况，与临床患者随访信息进行相关性分析;通过细胞实验研究TAMs促进肾母细胞瘤的相关分子机制，并对TAMs的极化过程进行初步的调控;应用超小型超顺磁氧化铁颗粒(Ultrasmall Superparamagntic lron Oxide，USPIO)作为药物载体，制作靶向纳米复合物精准调控TAMs的极化过程，抑制肾母细胞瘤的增殖、侵袭。
方法:
收集2006.04到2014.03在山东省立医院进行手术治疗的肾母细胞瘤患者信息，术前未行放化疗治疗，符合入组标准的共61人，其中男性44人，女性17人，中位年龄是19个月(2-106月)。根据NWTS-5分期标准，Ⅰ期27人，Ⅱ期18人，Ⅲ期16人。进行Western Blot、免疫组化、免疫荧光分别检测肿瘤与瘤旁组织中M1、M2型巨噬细胞表达情况，根据患者随访信息，制作Kaplan-Meier生存曲线，分析M1、M2型巨噬细胞表达与患者预后的相关性。
诱导THP-1分别极化为M1、M2型巨噬细胞，并应用PCR、Western Blot、免疫荧光等方法验证诱导结果。将M1、M2型巨噬细胞分别与肾母细胞瘤细胞SK-NEP-1共培养，通过CCK8、Transwell方法测定SK-NEP-1细胞活力、侵袭能力的改变，研究不同极化类型的TAMs对肾母细胞瘤的作用。应用PCR、Western Blot、ELISA从基因、蛋白角度研究M1、M2型巨噬细胞的差异表达MMP9蛋白，在肾母细胞瘤组织中应用Western Blot、免疫组化进一步分析MMP9的表达情况。对TAMs促肿瘤机制的相关信号通路，进行研究。研究M2型巨噬细胞极化过程中的重要信号通路STAT6作用机制，通过阻断该信号通路对肾母细胞瘤产生的影响。
应用碳二亚胺法将PEG修饰后的磁性纳米氧化铁颗粒USPIO分别与STAT6信号通路抑制剂AS1517499、CD163单克隆抗体耦联制作靶向纳米复合物AS1517499-USPIO-CD163(AUC)，测定靶向纳米复合物AUC的稳定性、水合粒径、铁浓度、AS1517499包封率载药率、CD163的抗体含量，透射电子显微镜观察靶向纳米复合物AUC的颗粒特点。应用Western Blot、免疫荧光法检测靶向纳米复合物AUC中AS1517499、CD163抗体的活性。通过AO/EB、流式细胞术测定AUC对M2型巨噬细胞凋靶向高选择性，并在TAMs与肾母细胞瘤共培养体系检测AUC的药物效果。
结果:
肿瘤相关巨噬细胞在肾母细胞瘤组织中高表达，表达量明显高于瘤旁正常组织，主要分布在肿瘤间质中。随临床分期增加，M2型巨噬细胞的数量逐渐增加，而M1型巨噬细胞数量逐渐降低，组间差异明显。通过Kaplan-Meier生存曲线分析，M1型巨噬细胞表达阳性的患者与表达阴性的患者的总生存率未见明显差异(p=0.074)，M2型巨噬细胞表达阳性的患者的总生存率明显低于表达为阴性的患者(p=0.011)。
THP-1细胞诱导为M1、M2型巨噬细胞成功，细胞表型鉴定可见M1型巨噬细胞中特异性蛋白CD80，iNos呈高表达，而M2型巨噬细胞中Arg-1，CD163，CD206表达较M1型巨噬细胞增多。将M1，M2型巨噬细胞分别与肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞共培养之后，通过CCK8，Transwell实验测定细胞的活力、侵袭能力变化，可以发现M2型巨噬细胞可提高肾母细胞瘤细胞的活力、侵袭能力。应用PCR、Western Blot、ELISA方法在基因、蛋白、细胞上清液角度测定两种亚型巨噬细胞中表达差异发现，MMP9在两者之间差异明显，且肾母细胞瘤组织中的MMP9也呈高表达。MMP9通过激活AKT/PI3K信号通路，降低E-Cadherin蛋白、增加N-Cadherin蛋白表达，启动上皮间充质转化(EMT)过程，明显增强SK-NEP-1细胞侵袭迁移能力。STAT6信号通路可以调控M2型巨噬细胞极化，应用抑制剂AS1517499后发现磷酸化的STAT6降低，M2型巨噬细胞特异性蛋白CD206，CD163的表达降低，在共培养体系中阻断STAT6信号通路可以明显减少M2型巨噬细胞极化，抑制肾母细胞瘤SK-NEP-1细胞的增殖、侵袭。
通过碳二亚胺法将纳米级的PEG修饰USPIO先后与AS1517499、CD163单克隆抗体耦联成功，靶向纳米复合物AS1517499-USPIO-CD163具有AS1517499、USPIO、CD163抗体的三重活性，其水合粒径小于100nm，稳定性良好，每1mgFe中有AS1517499约145.9±36.9μg，CD163抗体34±8.9μg，透射电镜观察其形态呈圆形或椭圆形颗粒，形态规则，大小均一，呈聚团分布，铁核直径在5nm左右。
结论:
在肾母细胞瘤中TAMs集聚、表达量增加，M1型巨噬细胞随着临床分期进展逐渐减少，而M2型巨噬细胞与临床分期呈正相关。M2型巨噬细胞的数量增加预示着患者不良的预后。M2型巨噬细胞可促进肾母细胞瘤的增殖、侵袭迁移，其主要作用机制可能为，通过分泌MMP9蛋白激活AKT/PI3K信号通路启动上皮间充质转化(EMT)过程。STAT6信号通路在M2型巨噬细胞极化过程有重要作用，其信号通路抑制剂AS1517499可明显减少M2型巨噬细胞的生成，对肾母细胞瘤起到抑制作用，可作为肾母细胞瘤治疗的新靶点进行深入研究。
靶向纳米复合物AS1517499-USPIO-CD163可通过碳二亚胺法合成，水合粒径小，稳定性良好，其中包含的STAT6信号通路抑制剂AS1517499及CD163抗体活性良好，可用于分子靶向治疗。靶向纳米复合物AUC的核心为磁性纳米级氧化铁颗粒，可主动被巨噬细胞吞噬导致凋亡，对M2型巨噬细胞有靶向高选择性，可作为靶向抗TAMs的治疗药物，对肾母细胞瘤的增殖、侵袭有明显的抑制作用。