随着人们日常生活水平的提高，肥胖症作为威胁人类健康的医学难题逐渐受到人们的重视。开发出一款安全有效的减肥产品成为各大医药企业争相实现的目标。1986年，霍夫曼罗氏公司（Hoffmann-La Roche Inc.）以抑制负责脂肪吸收的人体胰脂肪酶为目标，在一些土壤微生物中做了定向筛选，发现Streptomycestoxytricini（毒三素链霉菌）发酵液中存在胰脂肪酶的潜在抑制剂，并命名为Lipstatin。随后从此菌株发酵液中分离鉴定了Lipstatin的化学结构，同时使用化学修饰的方法得到一系列衍生物，其中包括Lipstatin氢化还原产物Orlistat。经长期研究Orlistat成功成为国际市场上畅销的减肥产品。目前已商品化的Orlistat的工业生产由发酵而得的Lipstatin为原料，通过半合成的方法获得。因此，Lipstatin的生物合成研究，不仅可以从分子和生化水平上阐释Lipstatin的生物合成路径，为Lipstatin的产量提高方面提供新的方法，也为使用组合生物合成的方法开发出活性更强的结构类似物奠定基础。　　我们在获得Lipstatin生物合成基因簇以及相关基因失活的突变株之后，首先筛选出培养基-2作为后续工作的发酵培养基，并建立了中间体的分离和纯化方法。在此基础上，我们陆续完成了各突变株中间体的分离和鉴定。其中，在△lstA和△lstB突变株的发酵液中没检测到相应的中间体;在△lstC和△lstD突变株的发酵液中分离鉴定了同一个中间体D-1;而在△lstE和△lstF突变株的发酵液中也分离到相同的中间体F-1和F-2。基于已完成的体内敲除实验，我们修订了Lipstatin的生物合成路径:两个特殊聚酮合成酶KS(Ⅲ) LstA和LstB负责识别亚麻油酸β氧化降解中的14碳中间体和正己基丙二酸CoA，将其直接缩合形成Lipstatin的碳骨架;在非核糖体合成酶NRPS LstE和甲酰基转移酶LstF的作用下，在PCP水平催化亮氨酸的甲酰化并使其上载到羰基的β位羟基上;AMP依赖的连接酶LstC活化中间体羧基，最后，经NADPH依赖的还原/异构酶LstD还原羰基并介导构建中心四元内酯环，从而完成Lipstatin的生物合成。　　在体外酶学活性验证的工作方面。目前，基本表达纯化了Lipstatin生物合成路径中相关的蛋白，并对单模块NRPS做了体外酶学活性的初步探究。首先使用焦磷酸试剂盒测试了NRPS中A功能域的底物特异性。结果表明，A功能域对亮氨酸和异亮氨酸有很强的底物特异性。因此，我们推测亮氨酸的甲酰化是由A功能域识别上载到PCP后发生的。另外，我们初步尝试了泛酰巯基乙胺转移酶Sfp催化的Apo-PCP向Holo-PCP的转化实验。在测活底物方面，我们已确定了两条长链脂肪酸（蛋白LstA和LstB的催化底物）的切实可行的化学合成方案。　　总之，我们在体内数据为支持的基础上，提出了更合理的Lipstatin生物合成路径。在表达纯化到相关蛋白后，对单模块NRPS做了体外酶学活性的初探究，为亮氨酸的甲酰化提供了充实的证据。