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目的神经酰胺(ceramide, Cer)、鞘氨醇(Sphingosine, SP)、1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine-phospate, S1P)均参与肿瘤浸润、增殖、血管生成等的调节,是重要的细胞信号转导分子。鞘氨醇激酶-1(Sphingosine kinasel, SPK1)是产生S1P的关键酶,亦是调节Cer/S1P动态平衡的关键酶,通过磷酸化Cer的产物SP生成S1P。目前已经证实利用N,N,一二甲基鞘氨醇(N,N-Dimethyl sphingosine,DMS)干涉SPK1/S1P信号途径后,HepG2细胞生长受到抑制,并可能发生凋亡,对人肝癌细胞血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)的分泌具有明显的下调作用。但SPK1/S1P信号途径是否具有调节人肝癌耐药细胞株BEL-FU凋亡、侵袭力及耐药特性的作用目前国内外均未见报道。本课题研究利用DMS干涉SPK1/S1P信号后对人肝癌耐药细胞株BEL-FU的凋亡、侵袭能力及耐药特性的影响。方法人肝癌耐药细胞株BEL-FU培养于含10%小牛血清、100u/L青霉素、100μg/L链霉素、20000ng/mL5-FU的RPMI1640培养基中,置于37℃、5%CO2孵箱中培养,0.25%胰蛋白酶消化,倒置显微镜下观察细胞生长状况,采用对数生长期的细胞进行实验。利用不同浓度的DMS处理人肝癌耐药细胞株BEL-FU,倒置相差显微镜及荧光显微镜观看凋亡形态变化,流式细胞仪检测凋亡发生;并用transwell小室模型测定侵袭力;Western blot杂交检测多药耐药相关蛋白1(Multidrug resistance-related proteinl, MRP1)表达的变化。结果1.SPK1/S1P信号途径对人肝癌耐药细胞株BEL-FU凋亡的影响。①流式结果显示:5-20μmoL/L浓度范围的DMS对细胞均有显著凋亡作用,并且具有剂量依赖效应。浓度组与对照组比较,及各浓度组间比较差异均有统计学意义(P<0.01),且呈剂量依赖效应。②形态学观察:倒置相差显微镜观察:正常细胞呈克隆性生长,细胞呈梭形或多角形。药物作用后主要表现为细胞内部颗粒、空泡增多,体积变小、形态变圆,较多细胞从贴壁状态脱落,悬浮于培养液中。随培养时间的延长和药物浓度的增大,变化渐趋明显。荧光显微镜观察:对照组仅有极少数早、晚期凋亡细胞;与对照组比较,各浓度组早、晚期凋亡细胞均增加,随着药物浓度的升高晚期凋亡细胞逐渐增加,一部分凋亡细胞细胞核出现碎裂,核碎片清晰可见。2.SPK1/S1P信号途径对人肝癌耐药细胞株BEL-FU侵袭力的影响。侵袭实验结果显示:5-20μmoL/L浓度范围的DMS均可使各浓度组的穿膜细胞数减少、侵袭力减弱,与对照组比较及组间比较差异均有统计学意义(P<0.01),且呈剂量依赖效应。3.SPK1/S1P信号途径对人肝癌耐药细胞株BEL-FU MRP1蛋白表达的影响。Western blot结果显示:对照组、10μmoL/L组及20μmoL/L组均有MRPl蛋白的表达,且10μmoL/L组及20μmoL/L组MRP1表达量均少于对照组,20μmoL/L组MRP1表达量少于10μmoL/L组。10μmoL/L组及20μmoL/L组光密度比值均小于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),但10μmoL/L组与20μmoL/L组比较光密度比值无统计学意义(P>0.05)结论1、DMS干涉SPK1/S1P信号后,可以引起人肝癌耐药细胞株BEL-FU的凋亡,且呈剂量依赖效应。2、DMS干涉SPK1/S1P信号后,可以降低人肝癌耐药细胞株BEL-FU的侵袭力,且呈剂量依赖效应。3、DMS干涉SPK1/S1P信号后,人肝癌耐药细胞株BEL-FU的MRP1蛋白表达量减少,从而说明了干涉SPK1/S1P信号后可以克服其耐药特性。