背景:在全球范围内,肺癌一直是最常见的恶性肿瘤,是癌症和癌症相关死亡的主要原因。非小细胞肺癌（NSCLC）是最常见的肺癌类型,占所有病例的85%,肺腺癌（LUAD）在NSCLC中占主导地位。目前NSCLC的治疗包括手术切除、放射治疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗等。尽管NSCLC的治疗取得了进步,但预后仍不令人满意,NSCLC患者的5年生存率仅可维持在10%-20%之间。大多数患者被诊断时即为晚期或转移状态,更易出现治疗耐药,预后不良。培美曲塞（Pemetrexed,PEM）是一种抗叶酸合成药物,通过破坏细胞内叶酸依赖性的正常代谢过程,抑制细胞复制,从而抑制肿瘤的生长,联合铂类可用于晚期或转移性非小细胞肺癌一线治疗。然而,PEM的耐药性和高剂量PEM给药引起的骨髓抑制、肾毒性等副作用限制了治疗效果和临床应用。因此,重新使用辅助抗肿瘤药物并联合用药,进一步维持化疗效果,降低毒副作用成为了人们关注的焦点。癌细胞进行代谢重编程,并转换为糖酵解为主的代谢模式,以提高其生存率,满足其对能量的需求,这种现象被称为“Warburg效应”。糖酵解水平的升高可以酸化细胞内微环境,降低药物吸收率,促进化学治疗/放射治疗抵抗。肿瘤细胞糖酵解的关键限速酶包括己糖激酶Ⅱ（HK Ⅱ）、血小板型磷酸果糖激酶（PFKP）和丙酮酸激酶M2（PKM2）。以上三种关键酶被证明有助于肿瘤发生发展。在肝癌中,通过激活EGFR/PI3K/AKT信号轴增强癌细胞的Warburg效应,从而促进肝癌细胞的增殖、侵袭和转移。在人类胶质母细胞瘤中,抑制EGFR的表达可以下调PI3K/AKT通路从而抑制糖酵解功能。最近的几项研究表明,以癌细胞中增强的糖酵解为靶点是一种很有前景的策略,可以使其对其他方式的治疗更加敏感,如化疗、放疗等。但如何通过靶向癌细胞糖酵解来提高肺腺癌治疗效果还有待深入研究。人参皂苷CK,是人参皂苷Rb1和Rb2在肠道细菌中的代谢产物,是一种具有良好前景的辅助抗肿瘤药物,在体内外可有效抑制多种肿瘤细胞的增殖、转移、侵袭,并诱导其凋亡,且具有安全性高、生物学功能多样的优点。CK通过下调糖酵解关键酶HK Ⅱ和PKM2,降低肝癌细胞糖酵解水平。另外,CK可增强乳腺癌细胞对顺铂的敏感性。然而,CK是否可增强肺腺癌细胞对PEM的敏感性尚不清楚。因此,本研究利用A549和PC9细胞系,探索人参皂苷CK联合PEM对人肺腺癌的治疗效果及潜在作用机制。目的:通过使用肺腺癌A549和PC9细胞系以及裸鼠移植瘤模型探究人参皂苷CK联合培美曲塞的联合治疗作用,并阐明其潜在作用机制。方法:1、通过CCK-8法检测CK及多种人参皂苷和PEM联合作用24h后的A549、PC9细胞活性。2、通过Compusyn软件计算CK/PEM联合用药的联合用药指数（CI值）。3、通过集落形成实验观察CK/PEM联合用药对A549、PC9细胞的增殖抑制作用。4、通过流式细胞术（Annexin V/PI双染色）检测CK/PEM联合用药对A549、PC9细胞凋亡的影响。5、通过流式细胞术检测CK/PEM联合用药对A549、PC9细胞周期阻滞的影响。6、DCFH-DA染色结合酶标仪、荧光显微镜检测CK/PEM联合用药对A549、PC9细胞中活性氧水平的影响。7、通过伤口愈合实验、Transwell实验检测CK/PEM联合用药对A549和PC9细胞的迁移能力和侵袭能力的影响。8、通过酶标仪检测不同药物处理后糖酵解终产物ATP及丙酮酸含量变化。9、Western blotting 分析 CK、PEM 和 CK/PEM 联合用药作用后 A549 和 PC9细胞及裸鼠移植瘤组织中相关蛋白水平的变化。10、通过建立BALB/c裸鼠移植瘤模型探究CK/PEM联合用药在体内环境中对肺腺癌的作用。11、通过HE染色及免疫组化染色检测CK/PEM联合用药对肿瘤形态、增殖指数以及重要脏器的影响。结果:1、人参皂苷CK、培美曲塞（PEM）均以浓度、时间依赖性方式抑制肿瘤细胞活性。与单独应用PEM相比,CK/PEM联用时,A549、PC9细胞系的活力均降低30%以上。在30 μMCK和2μMPEM处理A549和PC9细胞时,两药表现出了最佳协同效果,显著抑制集落形成（P＜0.01）,表明CK/PEM联用协同抑制了细胞增殖。2、在A549、PC9细胞系中,与单独使用CK或PEM相比,联合组所诱导的凋亡细胞百分比显著增加（P＜0.01）,CK促进了 PEM诱导的促凋亡蛋白（Cleaved-Caspase3,Bax）水平的增加和抗凋亡（Bc12）蛋白水平的降低。并且PEM促进了 CK诱导的A549和PC9细胞中活性氧的积累。3、CK处理后47%的A549细胞和53%的PC9细胞阻滞在G1期;PEM处理后58%的A549细胞和54%的PC9细胞阻滞在S期;CK/PEM联合组在将70%的A549和约67%的PC9阻滞在G1期。4、CK/PEM联合处理的A549、PC9细胞的迁移、侵袭能力显著降低。经CK/PEM治疗后,上皮标志物E-cadherin表达水平升高,间质标志物N-cadherin和波形蛋白表达水平降低。说明,CK/PEM主要通过抑制上皮-间充质转化（EMT）来抑制A549、PC9细胞的侵袭和迁移。5、转录组测序结果提示CK和CK/PEM联合用药可下调糖酵解通路基因表达,但PEM处理后对糖酵解通路基因表达并无明显影响。上述基因的RT-qPCR分析结果也证实CK及CK/PEM联合用药可显著下调糖酵解通路基因转录水平。6、与正常人肺上皮细胞系BEAS-2B相比,肺腺癌细胞系A549、PC9中的糖酵解关键酶HKⅡ、PFKP和PKM2水平显著升高。CK和CK/PEM联合用药组处理的肺腺癌细胞内糖酵解终产物ATP和丙酮酸含量均明显下降,而PEM组无显著变化。在CK处理的细胞中,糖酵解关键酶HKⅡ、PFKP和PKM2的蛋白水平被下调,而PEM对其无明显影响。7、外源补充丙酮酸钠可显著减轻CK和CK/PEM联合用药诱导的细胞死亡。并且,丙酮酸钠能逆转CK/PEM联合用药所诱导的细胞凋亡相关蛋白水平的改变。8、构建BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型,与单独用药相比,CK/PEM联合应用显著减小肿瘤体积,并抑制Ki-67的表达,且无明显毒副作用。Western blotting结果与体外实验结果一致,CK诱导异种移植瘤糖酵解功能障碍,联合用药组的糖酵解功能障碍进一步加重;与对照组及单独用药相比,CK/PEM联合用药可显著促进移植瘤凋亡,抑制肿瘤EMT。9、CK通过EGFR/AKT/G6PC3信号轴抑制肺腺癌细胞糖酵解,并且,PEM的存在会增强这种作用。结论:1、人参皂苷CK与培美曲塞协同降低肺腺癌A549、PC9细胞活力并抑制细胞增殖、诱导细胞周期阻滞、促进细胞凋亡、产生活性氧,并抑制细胞的侵袭与迁移。2、人参皂苷CK通过EGFR/AKT/G6PC3信号轴抑制肺腺癌细胞糖酵解从而增强培美曲塞在肺腺癌中的抗肿瘤作用。3、人参皂苷CK与培美曲塞协同抑制体内肺腺癌进展。