论文部分内容阅读
非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一种无过量饮酒史,以肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征。NAFLD已成为常见肝病之一,疾病谱随病程的进展表现不一,主要包括单纯性脂肪肝(nonalcoholic simple fatty liver, NAFL)、脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis, NASH)、脂肪性肝纤维化和肝硬化。在NAFLD漫长的病程中,NASH是NAFL发生肝硬化的必经阶段。肥胖、Ⅱ型糖尿病、高脂血症等单独或共同构成NAFLD的易感因素。但其发病机制至今仍存在争议,尚未阐明；且目前尚无确切有效治的疗药物。研究发现NAFLD患者多伴有小肠细菌过度生长(Small Intestinal Bacteria Overgrowth SIBO), SIBO可以影响体内脂质代谢,增加肝脏脂质沉积,对非酒精性脂肪肝的发生发展起到主要作用。尽管研究发现非酒精性脂肪性肝病患者存在小肠细菌过度生长及肠源性内毒素血症(Intestinal endotoxemia IETM),但其在NAFLD中的具体作用机制及对机体脂质代谢的影响机制尚未完全阐明。过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptors, PPARs)信号转导途径,在肝脏的脂质代谢过程中具有重要作用,且其亚型PPARa主要对肝脏脂肪酸及甘油三酯代谢进行调控。因此肠源性内毒素血症是否可通过影响PPARa mRNA的表达来影响肝脏脂质代谢有待进一步验证,对它们之间关系的研究可能为非酒精性脂肪肝的防治提供了新的方向。本实验研究了高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝炎大鼠血清内毒素水平的变化,及其肝组织PPARa mRNA的表达,并给予具有调节肠道菌群作用的微生态制剂进行干预,观察它对肝脏脂肪变和肠源性内毒素血症的作用,这对深入认识NAFLD的发病机制具有重要意义,并为非酒精性脂肪肝提供了新的治疗靶点。目的：1通过高脂饮食制作非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型；2探讨肠源性内毒素在NAFLD发病中的作用及其与PPARa的关系；3观察微生态制剂对实验性NAFLD的治疗效果,探讨其可能的作用机制。方法：1制备动物模型及实验设计：32只雄性SD大鼠,体重180±20g克,适应性喂养1周后随机分为3组,正常对照组12只,给予基础饲料喂养；造模组12只,治疗组8只,均给予高脂饲料喂养(88%普通饲料+5%蛋黄粉+1%胆固醇+10%猪油)。实验动物均分笼(每笼4只)饲养于25±2℃、明暗各12h的动物实验室内。自由饮水进食,于喂饲12周末取对照组和模型组各4只处死,行肝组织HE染色确定大鼠非酒精性脂肪肝模型成功。自13周开始治疗组给予双歧杆菌三联活菌肠溶胶囊(0.113g·kg-1·d-1)灌胃,对照组及模型组给予等容量蒸馏水灌胃。每周记录动物体重1次,根据体重变化调节灌胃计量,连续进行至16周末给药期结束,处死全部大鼠。2指标检测：(1)观察肝脏的大体情况,并完整切除肝脏,称肝脏湿重(2)进行肝组织切片的HE染色观察肝脏病理变化(3)采用全自动生化分析仪测定血清谷丙转氨酶,谷草转氨酶,总胆固醇,甘油三酯,高密度脂蛋白水平。(4)鲎试剂法测定血清内毒素水平(5)荧光定量PCR法检测肝组织PPRAa mRNA基因水平的变化。结果：1给予高脂饮食的大鼠于喂饲12周末出现肝脏脂肪变及炎症细胞浸润,表明高脂饮食成功制造了NASH大鼠模型。2大鼠体重、肝湿重及肝脏指数(肝湿重/体重×100%)于12周末对部分大鼠肝组织行HE染色确定成功复制大鼠NASH模型。其余大鼠于16周末再次称重,模型组大鼠的体重(570.85±13.41),肝重(19.81±2.47),肝指数(2.55+0.16%)均明显高于正常对照组的体重(507.43±11.65)、肝重(12.91±0.78)及肝指数(3.48±0.46)(P值均<0.01),有显著性差异。与模型组相比,治疗组体重(238.58士15.24)、肝重(15.37±1.23)及肝指数(2.93±0.22%)均明显降低(P<0.01),有统计学意义。3血清生化指标：(1)谷草转氨酶(AST)和血清谷丙转氨酶(ALT)：模型组AST为(204.88±18.22)较正常组(157.88±17.60)显著增高(P<0.01),而治疗组AST为(183.00±18.47),较模型组下降(P<0.05)。模型组ALT(71.00±8.73)较正常组(41.00±7.43)显著增高(P<0.01),而治疗组ALT为(45.88±15.06)较模型组显著下降(P值<0.01)(2)血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL)：模型组血清TG为(0.60±0.08)较正常组(0.31±0.08)显著升高(P<0.01),治疗组TG为(0.50±0.09)较模型组下降(P<0.05)；模型组血清TC为(1.20±0.18)较正常组(0.68±0.16)显著升高(P<0.01),治疗组TC为(1.02±0.17)较模型无显著性差异(P均>0.05)；模型组HDL(0.65±0.06)较正常组(0.82±0.08)显著下降(P<0.01),而治疗组HDL为(0.73±0.06),较模型组有所上升(P均<0.05)。4血清内毒素水平及肝组织PPARa mRNA表达水平模型组血清内毒素水平为(0.24±0.02)低于正常对照组(0.12±0.01)(P<0.01),治疗组血清内毒素水平为(0.17±0.02)较造模组血清内毒素水平明显下降(P<0.01)。正常对照组大鼠肝组织高表达PPARamRNA (1.62±0.35);造模组肝组织PPARa mRNA表达(0.66±0.25)较正常对照组显著减少(P<0.01)；治疗组PPARamRNA表达(0.10±0.23)较模型组有所增强(P<0.05),但较正常组下调(P<0.01),差异有统计学意义。5肝脏病理学改变实验结束时对大鼠肝组织行HE染色正常组大鼠肝细胞内无脂肪变性,且均无炎症细胞的浸润；于光镜下观察模型组大鼠12周末肝组织可见弥漫性的肝细胞脂肪变性,伴有少量炎症细胞浸润。而后随着造模时间的延长,脂肪变程度逐渐加重,于16周末脂肪变程度以重度为主,以中央静脉周围组织脂肪变最明显,还可见到程度不等的小叶内炎症,汇管区炎症及点灶状坏死,与正常组相比有显著性差异(P<0.01)。与模型组相比,治疗组肝细胞脂肪变性程度较模型组明显改善(P<0.01)；治疗组炎症分级较模型组无明显改善(P>0.01)。结论：1高脂饮食可成功建立大鼠NASH模型。2小肠细菌过度生长及肠源性内毒素在NAFLD发病过程中可能起到了重要作用,且内毒素可能通过影响PPARa mRNA的表达对肝脏脂质代谢进行调节,这一发现对深入认识NAFLD的发病机制具有重要意义。3微生态制剂可显著减轻NAFLD大鼠肝细胞脂肪变,改善肝功能和血脂异常,降低PPARamRNA的表达,对NASH能够起到一定的治疗作用。