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原生质体再生成植株是一个复杂的发育过程,包括细胞壁再生、细胞伸长和分裂,随后进入细胞周期并再生成胚状体。这个过程中如果出现逆境,胞内会积累不同程度的活性氧(AOS),产生氧化胁迫,影响原生质体再生成植株。多胺作为抗氧化剂,能清除细胞中的活性氧,提高抗氧化酶活性,影响细胞发育。本文探讨了从不同材料中所分离的原生质体在细胞壁再生期间的差异,以及壁再生过程中,多胺对细胞应对氧化胁迫的影响。主要研究结果如下:
1.对椪柑愈伤组织与叶片酶解、分离原生质体,进行液体浅层培养,荧光染料Calcofluor White M2R染色观察不同材料分离原生质体细胞壁再生时间,观察结果表明,愈伤组织分离的原生质体在第3d就开始启动细胞壁再生程序,到第6d完成细胞壁再生;而叶肉分离的原生质体随着培养时间的延长,逐渐死亡,无法观察到细胞壁的再生。
2.对愈伤组织与叶片分离的原生质体过氧化氢与抗氧化物质活力检测结果表明,过氧化氢与抗氧化物质的活力变化在两个不同材料分离的原生质体中出现了广泛的差异,随着培养时间的增加,过氧化氢在不能再生的原生质体中逐渐增加,而在能再生的原生质体虽然有一定的增加,但是增加幅度明显少于叶肉分离的原生质体中过氧化氢的活力;相应的抗氧化酶,在愈伤组织分离的原生质体培养过程中都相应增加,但是在叶肉分离的原生质体培养过程,酶的活力基本保持不变,并有些呈下降的趋势。
3.添加D-Arg(10mM)处理的愈伤组织分离的原生质体,过氧化氢在原生质体随着培养时间逐渐增加,相应的细胞体内清除酶的活性下降;而在叶肉分离的原生质体添加腐胺(10mM),过氧化氢在植物体内持续积累,清除酶的活性变化不明显。
4.分离椪柑愈伤组织得到原生质体,在培养基中添加外源多胺与多胺抑制剂进行培养,荧光增白剂染色观察表明,添加了外源多胺促使原生质体细胞壁启动提前,而添加多胺抑制剂的相对延后。
5.对愈伤组织与叶片进行分离得到原生质体培养过程中取样,通过FDA染色检测得到,随着培养时间的增加,愈伤组织分离的原生质体活力高于叶片分离的原生质体。
6.为了从单细胞水平对原生质体进行研究,分离愈伤组织的原生质体进行固体半包埋培养,并对细胞的分裂进行观察,观察结果表明,原生质体第7天均开始分裂,表明原生质体已经完成了细胞壁再生。