论文部分内容阅读
大黄鱼(Larimichthys crocea)是我国特有的最重要的海水经济鱼类之一,在生长上存在性别二态性,但是目前对其性别决定机制的了解还比较欠缺。对大黄鱼性别决定关键基因的研究,有助于今后繁殖生产和育种工作的开展。本研究从在大黄鱼精巢特异性表达的Dmrt1基因入手,克隆了其全长cDNA及X和Y染色体上Dmrt1基因(分别称为LcDmrt1~X和LcDmrt1~Y)的启动子序列,构建了该基因的表达载体注射到青鳉受精卵观察其表达和对青鳉性别发育的影响,并通过构建荧光素酶报告基因载体,对启动子活性区域进行了初步分析。主要研究结果如下:1、通过RACE技术获得了大黄鱼Dmrt1基因(LcDmrt1)的全长cDNA序列,共3037bp,其中包括918 bp的ORF,132 bp的5’UTR和1932 bp的3’UTR。以大黄鱼BAC文库中包含Dmrt1基因的X和Y染色体片段的单克隆为模板扩增了Dmrt1基因启动子区的核苷酸序列,发现两者之间存在许多SNP和插入缺失变异。生物信息学软件预测的结果表明,LcDmrt1的启动区存在多个转录因子结合位点,包括TATA结合蛋白(TBP)、SMAD2以及性别相关蛋白SOX家族成员(SOX5、SOX10、SOX17)和SRY等结合位点;其中,LcDmrt1~Y在-1375 bp处含有1个特异的TBP结合位点,LcDmrt1~X在-1813 bp处和在-2416bp处分别有一个特异的SOX5结合位点和SRY结合位点。此外,LcDmrt1~Y在启动子区还含有2个DMRT1结合位点,分别位于-1040 bp和-287 bp处,而LcDmrt1~X有3个DMRT1的结合位点,分别位于-1820 bp,-1048 bp和-298 bp处,其中-1820处的DMRT1结合位点是X染色体特异的。2、利用克隆的大黄鱼Dmrt1全长cDNA成功构建了PCS2-LcDmrt1过表达载体,利用显微注射技术导入模式鱼青鳉受精卵中,观察LcDmrt1在青鳉体内的基因整合、表达和对青鳉性别发育的影响。结果表明,注射48 h后,LcDmrt1基因在青鳉胚胎内大量表达,孵化后40 d的稚鱼中LcDmrt1的整合率为24.3%,并观察到1尾遗传型为XX的青鳉发育成了雄鱼,表明LcDmrt1具有诱导青鳉雌鱼性腺分化发育成精巢的作用。3、构建了含有LcDmrt1~X和LcDmrt1~Y不同长度启动子序列的双荧光素酶报告载体Pro-D2K-X(-1983,+133)、Pro-D2K-Y(-1975,+133)、Pro-D700-X(-615,+133)和Pro-D700-Y(-607,+133)。分别共转染人胚胎肾细胞系(HEK-293)检测其表达活性。结果表明,LcDmrt1~X和LcDmrt1~Y启动子都有活性,LcDmrt1~Y的启动子活性高于LcDmrt1~X的启动子。将上述4种启动子活性分析质粒分别与PCS2-LcDmrt1共转染,观察LcDmrt1是否有自我反馈的调节机制。结果表明,过表达LcDmrt1会降低启动子活性,说明大黄鱼DMRT1具有具有负反馈调节作用,结合LcDmrt1~Y启动子的表达活性明显高于LcDmrt1~X的结果分析,表明LcDmrt1的抑制程度可能与其启动子区DMRT1结合位点数目有关,其中包含3个DMRT1结合位点的LcDmrt1~X的启动子活性受到抑制的程度明显高于2个结合位点的LcDmrt1~Y启动子。此外,LcDmrt1~Y的这种自我抑制作用具有剂量效应,具有2个DMRT1结合位点的Pro-D2K-Y启动子活性受到抑制的程度显著高于只有1个DMRT1结合位点的Pro-D700-Y的启动子活性(p<0.05);而LcDmrt1~X的结果正好相反,共转染后Pro-D700-X表达活性下降幅度极显著大于Pro-D2K-X,暗示(-615 bp,0)区域中的结合位点可能是该启动子接受DMRT1的负反馈调节的主要位点。本研究获得了大黄鱼Dmrt1基因cDNA全长序列和X与Y染色体上该基因的启动子序列,并成功构建了一系列表达质粒,初步揭示了DMRT1的功能及X、Y染色体上LcDmrt1启动子的表达特性,研究结果为阐明大黄鱼性别决定与分化的分子机制,提供了良好的基础和有价值的研究资料。