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阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种隐匿起病进行性发展,与年龄相关的中枢神经系统退行性疾病。目前全球约有5000万人患有阿尔兹海默病,且发病率不断增加,而临床上尚无改善该疾病,阻止其进展的有效方法,因此探究AD潜在发病机制,开发理想的治疗药物是治疗AD的必要条件。AD的主要病理学特征包括皮层尤其是海马中的突触和神经元减少,神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles,NFTs）、淀粉样β蛋白沉积等。有研究发现在神经细胞、动物模型及AD患者脑内均有细胞凋亡的发生,β-淀粉样蛋白（β-amyloid,Aβ）异常聚集诱导的神经细胞凋亡则是引发AD神经毒性的重要原因之一。而自噬作为调控凋亡的关键因素也被认为可能参与AD疾病的发生。有研究认为Aβ可能调节细胞膜上的钙离子通道促进胞外Ca2+内流导致钙超载,通过与神经功能调控相关的Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶β(Ca2+/Calmodulin-dependent protein kinase kinaseβ,CaMKKβ),使得下游腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）被激活,从而抑制自噬的负性调控因子雷帕霉素靶蛋白（rapamycin target protein,mTOR）激活自噬,增加神经元对兴奋性毒性和细胞凋亡的敏感性,引发脑损伤。作为AMPK上游激酶的CaMKKβ,在AD细胞模型中因钙超载而被激活从而激活下游AMPK/mTOR信号通路的这一作用可被CaMKKβ抑制剂STO-609所抑制。ST2-104多肽是近年来由钙通道结合区(Ca2+channel binding domain,CBD3)设计的新型小分子多肽。其具有九个精氨酸跨膜肽融合体,可靶向神经细胞膜上的钙离子通道如N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptors,NMDARs）。前期研究已经证明ST2-104多肽可抑制钙通道受体过度激活,减轻钙超载,使得神经元损伤减少。在此基础上本研究将进一步探讨ST2-104多肽抑制神经元凋亡的作用及其可能机制,为其治疗阿尔兹海默病提供坚实的理论基础。目的:本研究拟建立Aβ25-35诱导人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞损伤模型,给予自噬激动剂rapamycin（RAPA）和CaMKKβ抑制剂STO-609,探讨ST2-104多肽通过CaMKKβ/AMPK/mTOR信号通路在SH-SY5Y细胞自噬及凋亡的影响。方法:本研究首先采用Aβ25-35诱导人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞建立凋亡模型,ST2-104给药处理进行干预。细胞分为Con（空白）组,Aβ25-35（模型）组、ST2-104组和Aβ25-35+ST2-104组。采用MTT法检测SH-SY5Y细胞活力,Hoechst 33258荧光染色观察细胞凋亡水平,MDC荧光染色观察细胞自噬,流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）检测细胞内的钙离子浓度,Western blot检测凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、caspase-3）、自噬相关蛋白（LC3B、Beclin-1）以及CaMKKβ/p-AMPK/p-mTOR的表达水平。为研究自噬和凋亡之间的关系,应用自噬激动剂rapamycin（RAPA）预处理SH-SY5Y细胞后与与Aβ25-35共孵育,Hoechst 33258荧光染色观察细胞凋亡水平,Western blot检测凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、caspase-3）表达水平。为探究CaMKKβ在ST2-104多肽保护Aβ25-35诱导细胞凋亡中的作用,应用CaMKKβ抑制剂STO-609预处理SH-SY5Y细胞,Hoechst 33258荧光染色观察细胞凋亡水平,MDC荧光染色观察细胞自噬水平,Western blot检测凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、caspase-3）、自噬相关蛋白（LC3B、Beclin-1）以及CaMKKβ/p-AMPK/p-mTOR表达水平。结果:MTT结果显示,与Con组比较,Aβ25-35组在5μM,24 h条件下处理细胞,细胞活力显著降低（P<0.01）;Hoechst 33258荧光染色观察到细胞核固缩,致密浓染,呈碎块状;MDC荧光染色观察到细胞核碎裂成点状被染成绿色颗粒荧光强度增加;FCM检测到胞内钙离子浓度显著增加;Western blot结果显示Bax,C-caspase-3蛋白表达显著增加（P<0.01）,Bcl-2蛋白表达明显降低（P<0.05）,自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-II表达明显增加（P<0.01）,CaMKKβ、p-AMPK蛋白表达显著增加（P<0.01）,p-mTOR蛋白表达显著降低（P<0.05）。ST2-104预处理30 min后与Aβ25-35共孵育24 h,与Aβ25-35组比较,5μM ST2-104+Aβ25-35组MTT结果显示细胞活力明显增加（P<0.01）;Hoechst 33258荧光染色观察到荧光强度降低,凋亡细胞明显减少;MDC荧光染色观察到被染成绿色颗粒的点状结构显著减少,荧光强度明显减弱;FCM检测到胞内钙离子浓度显著减少;Western blot结果显示Bax,C-caspase-3蛋白表达显著减少（P<0.05,P<0.01）,Bcl-2蛋白表达明显升高（P<0.05）,自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-II表达显著减少（P<0.05,P<0.01）,CaMKKβ、p-AMPK蛋白表达显著降低（P<0.05,P<0.01）,p-mTOR蛋白表达显著增加（P<0.05）。应用自噬激动剂RAPA预处理SH-SY5Y细胞,结果显示RAPA可阻断ST2-104多肽对Aβ25-35诱导细胞凋亡的保护作用。应用CaMKKβ抑制剂STO-609预处理细胞,结果显示STO-609显著拮抗了Aβ25-35诱导的细胞凋亡、自噬以及抑制了CaMKKβ/AMPK/mTOR信号通路。而且STO-609可增强ST2-104多肽作用。结论:ST2-104多肽可显著抑制Aβ25-35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡,其机制可能是ST2-104多肽抑制了Aβ25-35诱导的细胞内钙超载,进而通过阻断CaMKKβ/AMPK/mTOR信号通路,抑制自噬,并进一步抑制细胞凋亡。