研究背景和目的乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)是一种肝向性DNA病毒,严重威胁人类的健康。孕妇感染HBV后,可能经胎盘垂直传播给胎儿,引起宫内感染,是我国人群HBV传播的重要途径。乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)是HBV的一种辅助蛋白,并不参与病毒的复制和组装。HBeAg阳性慢性乙型肝炎(CHB)孕妇常持续感染HBV,并导致宫内感染。研究发现,HBeAg能抑制CHB患者的肝细胞、外周血单核细胞和Kupffer细胞Toll样受体2(TLR2)表达及其介导的天然免疫反应,相似的是,在HBeAg阳性CHB患者的外周血树突状细胞Toll样受体3(TLR3)表达减少。此提示,HBeAg在病毒感染过程中可能起免疫调节作用,促进病毒持续感染。Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)是一种近年来新发现的模式识别受体,可识别和应答病原体相关分子模式(PAMPs),在抵御各种病原微生物的免疫应答中发挥重要作用。天然免疫系统是机体抗病原体感染的第一道防线,TLRs家族是其中重要的组成部分。TLRs可广泛表达于哺乳动物的组织和细胞中。至今,已发现和鉴别了10种人属TLRs,在人胎盘组织均可表达,TLR3、TLR4主要表达于胎盘滋养层细胞。TLRs信号传导包括2条途径：MyD88依赖性和非依赖性途径,TLR3信号传导主要通过MyD88非依赖的TRIF途径,而TLR4主要通过MyD88依赖性或非依赖性途径传导信号。TLR3、TLR4可介导抑制肝脏细胞、外周血树突状细胞中HBV复制。TLR3可识别病毒双链RNA(dsRNA)并发生免疫应答,滋养层细胞在TLR3的配体多聚肌胞(polyI:C)处理后可产生Ⅰ型干扰素(IFN-α／β),而IFN-β是由TLR3诱导细胞产生的主要细胞因子；以TLR4的配体脂多糖(LPS)刺激绒毛滋养层细胞可产生前炎症细胞因子(如TNF-α)和趋化因子(如IL-8)。此提示,胎盘滋养层细胞可能通过TLR3、TLR4识别病毒相关分子模式并触发抗病毒反应。胎盘作为一种特殊的物理和免疫屏障,在防御不同微生物的侵袭中起重要作用。胎盘屏障的第一层细胞是滋养层细胞,该层细胞直接与母亲血液接触,可识别病原微生物并对其作出相应的免疫应答。因此,滋养层细胞在防御HBV宫内感染中可能发挥重要的作用。但是,关于HBeAg阳性CHB孕妇持续感染HBV并导致宫内感染的机制尚不清楚。Bewo细胞是一种人胎盘绒毛癌细胞系,现已被广泛用于滋养层细胞功能的研究。本研究拟分别构建1.3倍HBV基因组及HBeAg的真核表达载体,转染Bewo细胞,建立HBV和HBeAg表达的细胞模型,并以此研究HBeAg对人胎盘滋养层细胞TLR3／4的表达及其生物效应的影响,探讨胎盘HBV持续感染并垂直传播给胎儿的机制,为防治HBV宫内感染提供新的理论和实验依据。方法1. HBeAg阳性慢性乙型肝炎孕妇胎盘组织TLR3、TLR4的表达及意义：选取22例HBeAg阳性和24例HBeAg阴性CHB孕妇,及正常孕妇25例。建立实时荧光定量RT-PCR检测胎盘组织中TLR3、TLR4mRNA水平,同时以免疫组化法检测其在胎盘组织中的表达,并采用荧光定量PCR(FQ-PCR)和微粒子酶免疫分析法(MEIA)分别定量检测其血清HBVDNA和HBeAg水平。2.TLR3、TLR4介导的天然免疫对Bewo细胞中HBV复制的作用：以质粒pMD18T-HBV上的HBVDNA序列为模板,构建1.3倍HBV全基因序列基因,将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),用酶切、PCR及测序鉴定,并把该载体转染Bewo细胞,以Western免疫印迹、MEIA和FQ-PCR分别检测胞内和上清中HBsAg、HBeAg的表达及HBV DNA水平。以RT-PCR和ELISA分别检测细胞TRIF、MyD88 mRNA表达及其上清IFN-β、TNF-α水平。3. HBeAg对Bewo细胞TLR3、TLR4表达及其生物效应的影响：用PCR方法从质粒pMD18T-HBV中扩增HBeAg基因,克隆到pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBe,通过酶切、PCR及测序鉴定,并把该载体转染Bewo细胞,用Western免疫印迹和MEIA检测胞内和上清中HBeAg的表达。以FQ-PCR和ELISA分别检测细胞TLR3、TLR4 mRNA表达及细胞上清IFN-β、TNF-α水平,并采用免疫荧光染色法检测细胞NF-κB p65核转运。结果1. HBeAg阳性CHB孕妇胎盘组织中TLR3、TLR4 mRNA表达水平显著低于正常对照组和HBeAg阴性组,两组相比差异有统计学意义(P=0.000)；但HBeAg阳性CHB孕妇血清HBeAg及HBV DNA水平显著高于正常对照组,两者比较差异有统计学意义(P=0.000)。且免疫组化结果显示,TLR3主要表达于胎盘合体滋养层细胞和绒毛滋养层细胞的胞膜和胞浆,而TLR4主要表达于该细胞的胞膜。HBeAg阳性CHB孕妇胎盘组织中TLR3和TLR4表达的平均光密度值明显低于正常对照组和HBeAg阴性组,两者比较差异有统计学意义(P=0.000)。胎盘组织中TLR3、TLR4 mRNA表达与HBeAg水平呈负相关(r=-0.495,P<0.05,r=-0.450,P<0.05),而与血清HBV DNA水平无显著相关性。2.通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建了1.3倍HBV全基因表达载体,该载体可以在Bewo细胞中表达和分泌HBsAg与HBeAg,并可检测到高水平的HBV DNA。对Bewo细胞转染2μg或8μg HBV重组质粒,与对照组比较,polyI:C和LPS可显著抑制HBV复制(P<0.01),但转染8μg HBV重组质粒时,polyI:C和LPS对HBV复制的抑制率显著下降(P<0.01)。抗TLR3、抗TLR4可显著逆转polyI：C和／或LPS对HBV复制的抑制作用(P<0.01),抗IFN-β也可逆转polyI：C对HBV复制的抑制作用(P<0.01),但不能逆转LPS的作用(P>0.05)。与对照组相比,polyI:C可显著诱导Bewo细胞产生IFN-β和TNF-α(P<0.05或0.01),LPS可诱导细胞产生TNF-α,差异有显著性意义(P<0.05或0.01),但不能诱导IFN-β表达,二者均呈剂量和时间依赖性。NF-κB拮抗剂PDTC可抑制polyI:C和LPS诱导细胞产生TNF-α,显著低于对照组(P<0.01),但对IFN-β无显著作用。以polyI:C或LPS处理HBV重组质粒转染的Bewo细胞,可分别诱导TRIF mRNA或MyD88 mRNA表达,显著高于对照组(P<0.01)。3.通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建HBeAg表达载体,该载体可以在Bewo细胞系中表达HBeAg,并可分泌HBeAg。与对照组相比,polyI：C和LPS可显著诱导Bewo细胞TLR3和TLR4 mRNA表达(P<0.05或0.001),呈剂量和时间依赖性；IFN-β可诱导细胞TLR3 mRNA表达,显著高于对照组(P<0.01),但对TLR4 mRNA的表达无明显作用。对Bewo细胞转染2μg或8μg HBeAg重组质粒,再以polyI:C和LPS处理,转染8μg HBeAg重组质粒组其TLR3或TLR4的表达及IFN-β、TNF-α水平显著低于对照组(P<0.01)。外源性HBeAg可显著下调polyI：C诱导Bewo细胞TLR3 mRNA表达及IFN-β、TNF-α产生(P<0.05或0.01),也可抑制LPS诱导TLR4 mRNA表达及TNF-α产生(P<0.05或0.01),呈剂量依赖性。Bewo细胞在polyI:C或LPS作用下,NF-κB p65入核的数量显著高于对照组(P<0.01),但内源性和外源性HBeAg均可显著抑制polyI:C或LPS激活NF-κB(P<0.01)。结论1. HBeAg阳性CHB孕妇血清]HBeAg持续高表达,且其宫内感染率显著高于正常及HBeAg阴性孕妇,但胎盘组织TLR3、TLR4的mRNA、蛋白水平表达均显著低于其余两组；胎盘组织中TLR3、TLR4 mRNA表达与HBeAg水平呈负相关。此提示,HBeAg阳性CHB孕妇宫内感染HBV与TLR3、TLR4低表达关系密切,其对胎盘TLR3、TLR4表达可能起负调节作用。2.成功构建了1.3倍HBV全基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBV1.3,为研究HBV宫内感染的机制奠定了基础。通过诱导Bewo细胞产生IFN-β和TNF-α,TLR3、TLR4介导的天然免疫应答可抑制HBV复制,但随着HBV感染量的增大,其对HBV复制的抑制作用显著下降。TLR3介导抑制Bewo细胞中HBV复制主要呈TRIF依赖性,而TLR4主要依赖于调节蛋白MyD88。此提示,激活TLR3、TLR4可能成为一种新颖和有效防治HBV宫内感染的方法。3.成功构建了HBeAg真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBe,为研究内源性HBeAg对Bewo细胞TLRs表达的作用奠定了基础。polyI：C和LPS可显著诱导Bewo细胞TLR3、TLR4 mRNA表达,且可通过IFN-β自分泌反馈诱导TLR3表达。HBeAg通过下调细胞TLR3、TLR4 mRNA的表达,抑制NF-κB激活和细胞因子产生,从而干扰Bewo细胞的免疫功能。此提示,HBeAg下调胎盘滋养层细胞TLR3和TLR4表达效应可能是引起HBV宫内感染的一个重要的原因。主要创新点1.成功构建了1.3倍HBV全基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBV1.3,建立了新型的滋养层细胞HBV表达模型,为研究HBV宫内感染奠定了基础。2.成功构建了HBeAg真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBe,建立了滋养层细胞]HBeAg表达模型,为研究胞内HBeAg对滋养层细胞TLRs表达及其生物效应的影响提供了一个良好的平台。3. HBeAg可下调胎盘滋养层细胞TLR3、TLR4表达及其生物效应,可能是胎盘持续感染HBV,并引起宫内感染的一种新的机理,对防治HBV宫内感染提供了新的理论和实验依据。