【摘 要】
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本研究以牛的体细胞核移植为主题,比较了牛卵母细胞的不同采集方法、成熟培养方法以及牛卵母细胞的孤雌激活方法;分离并传代培养了牛的不同体细胞;并在此基础上较为深入的研究了影响牛体细胞核移植过程的激活方法、融合条件、发育培养的气相条件和供体细胞的血清饥饿状态等各个环节,比较了供体细胞的不同种类、不同来源和不同代次对重构胚发育的影响。 一、牛卵母细胞的采集、成熟培养及孤雌激活 1.以两种不同的
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本研究以牛的体细胞核移植为主题,比较了牛卵母细胞的不同采集方法、成熟培养方法以及牛卵母细胞的孤雌激活方法;分离并传代培养了牛的不同体细胞;并在此基础上较为深入的研究了影响牛体细胞核移植过程的激活方法、融合条件、发育培养的气相条件和供体细胞的血清饥饿状态等各个环节,比较了供体细胞的不同种类、不同来源和不同代次对重构胚发育的影响。 一、牛卵母细胞的采集、成熟培养及孤雌激活 1.以两种不同的采集方法,即抽吸法和切剖法采集了屠宰母牛卵巢卵母细胞,比较了采卵率,耗时和成熟率。结果表明:牛屠宰卵巢的采集方法不同直接影响可用卵的采得率和采卵的耗时,切割法所得可用卵母细胞数（9.22枚/卵巢）显著地高于抽吸法（6.58枚/卵巢）,但其耗时（117.57s/卵巢）极显著地高于抽吸法（52.13s/卵巢）,而采集方法对卵母细胞的成熟无影响。 2.用三种不同培养方法,即覆盖石蜡油的100μl微滴,4孔板内覆盖石蜡油的400μl的培养液和35mm塑料皿内3ml未覆盖石蜡油的培养液对牛卵母细胞进行了成熟培养,比较了三种方法的卵母细胞成熟率。结果表明:培养液体积的不同对卵母细胞的成熟培养无显著影响。 3.经过成熟培养的牛卵母细胞用离子酶素联合6-DMAP和乙醇联合6-DMAP等两种不同的激活方法处理,比较孤雌发育效果。结果表明:两种激活方法对牛卵母细胞的激活效果无显著差异,但离子酶素联合6-DMAP处理组的8细胞发育率和囊胚发育率（67.8096和36.92%）要比乙醇联合6-DMAP处理组（59.77%和22.36%）更高一些。 二、牛体细胞的分离与体外培养 1.用三种方法进行了牛颗粒细胞的原代培养,结果表明:将成熟培养后的卵母细胞去卵丘,收集颗粒细胞培养的方法简单可行,污染几率低,原代培养时间只需2-3天,是颗粒细胞原代培养最好的方法。 2.通过绘制生长曲线,研究了牛颗粒细胞和耳皮肤成纤维细胞的增殖规律,结果表明:
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