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迄今为止,从12种植物中克隆到了50多个抗病基因。本研究应用从已知抗病基因最常见的保守结构域NBS上设计的简并引物,通过改良的AFLP和3’RACE方法分别从玉米基因组DNA和cDNA中扩增抗病基因同源体(resistance gene analogs, RGA);同时利用公布的玉米EST数据库,利用已知抗病基因的全长序列,采用数据库检索(data mining)的方法,分离抗病基因同源ESTs(R-gene-like ESTs);然后,将获得的抗病基因相关序列定位到玉米基因组上构建连锁图谱,具体结果如下: 将AFLP方法和NBS简并引物相结合发展改良的AFLP方法,扩增玉米基因组DNA上抗病基因同源序列。以64个AFLP选择性扩增引物和NBS简并引物组成引物对,扩增得到大量的DNA片段,经过回收、克隆和测序,得到的285个非冗余的序列,通过在GenBank中Blast验证,有23个属抗病基因同源序列,所占的比例达到了8%以上。 用改良3’RACE方法,以cDNA为模板,用RACE试剂盒所带的upm引物和NBS简并引物组合扩增RGAs,扩增产物以1.5kb、0.75kb和0.5kb为主带呈连续分布。选择1.5—2.0kb扩增产物切割回收并克隆,测序得到的246个非冗余的序列,有12个是抗病基因同源序列,约占5%。 数据库检索(Data mining)鉴别抗病基因同源ESTs:迄今为止,玉米数据库中的EST数量已经超过了55万,试验证明覆盖了玉米基因组的大部分表达区域。通过在MaizGDB和GenBank等数据库中的检索、验证、再检索反复三次Blast,总共得到185个抗病基因同源ESTs,其中有110抗病基因同源的Unigenes和75抗病基因同源Singleton ESTs。在这185个抗病基因同源的Unigenes或Singleton EST中,有66个其推导的编码产物含有NBS-LRR结构域,有59个其推导的编码产物含有LRR结构域,有60个其推导的编码产物含有PK或PK/PK结构域。 发展基因标签标记定位所获得的抗病基因相关序列:根据RGAs的序列设计引物从豫玉22号的两亲本‘87-1’和‘综3’中扩增抗病基因相关序列,再根据序列多态性发展STS、CAPS和SNP等基因标签标记,总共发展了53个RGAs的基因标签标记。以豫玉22号的第10代293个重组自交系(R1L)为定位群体检测发展的基因标签标记在定位群体上的带型数据。用Mapmaker3.0作图软件将这些RGAs整合到豫玉22号高密度SSR标记连锁图谱上构建了玉米抗病相关基因连锁图谱。有48个RGAs定位到连锁图的49个位点(其中RGA-mla2定位在两个位点)。只有5个RGAs的标记数据不能整合到87-1×Z3重组自交系的连锁图上。 根据定位的结果发现,RGAs在玉米整个染色体上的分布是不均匀的,分布最多的是第一、第四和第十染色体,最少的是第五和第七染色体,这与目前为止已经定位的抗病基因或抗病QTL在玉米基因组上的分布相一致:此外,RGAs在各条染色体上分布也是不均匀的,而是大多数聚集成簇的,这与抗病基因大多是以家族多拷贝形式存在相一致。