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血管生成是一种复杂、多步骤的生物过程。它在许多正常生理过程,如创伤修复、胚胎发育以及女性生理周期等是必需的;而血管生成异常则与多种疾病相关,包括缺血性疾病、慢性炎症以及恶性肿瘤等。血管生成贯穿了肿瘤发生、生长和浸润转移的全过程,抑制肿瘤血管生成(Anti-angiogenesis)已被公认为肿瘤治疗的有效途径。促血管生成因子与抗血管生成因子之间的平衡是血管生成的关键。寻找理想的肿瘤血管靶向分子来抑制肿瘤细胞侵袭、迁移、血管生成以及促进肿瘤正常化的研究,是目前肿瘤的热点研究之一。迁移侵袭抑制蛋白(MIIP),是以胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP2)作为诱饵蛋白,从人胎脑cDNA文库中通过酵母双杂交筛选时发现的一个抑癌基因。迁移侵袭抑制蛋白可以通过与不同的靶蛋白相互作用,抑制肿瘤细胞周期、迁移及侵袭能力,从而抑制肿瘤的发生和发展。最新研究发现,MIIP除了能调节胰岛素样生长因子结合蛋白IGFBP2外,还能结合组蛋白脱乙酰基酶6(HDAC6)、热休克蛋白90(HSP90)、皮层肌动蛋白等,影响其对微管细胞骨架系统的乙酰化调节,使微管形成受到影响进而抑制细胞迁移。目前,还未见任何MIIP与肿瘤血管生成之间的文献报道,故本研究旨在利用体内、体外实验,明确MIIP对肿瘤血管生成的抑制作用以及探索MIIP抑制肿瘤血管生成及可能的分子机制,对判定MIIP能否成为可靠的抗肿瘤治疗靶向分子具有非常重要的意义。本课题主要从以下几个方面展开研究,并取得相应的成果:1)MIIP对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的迁移、侵袭及成管能力的影响:我们在HUVEC中对MIIP的表达水平进行过表达后,通过划痕愈合实验(Wound healing assay)及Transwell chamber实验观察HUVEC迁移及侵袭能力的变化;通过小管形成实验(Tube formation assay)观察了MIIP对HUVEC体外成管能力的影响;通过MTT实验和EdU细胞增殖实验,检测了HUVEC增殖能力的变化;利用HUVEC+Matrigel体内血管新生模型,检测了MIIP对血管内皮细胞血管新生能力的影响。实验结果表明,在HUVEC中过表达MIIP能显著抑制HUVEC的体外迁移、侵袭和成管能力,并能抑制HUVEC在体内水平的血管新生能力,但对HUVEC的增殖能力没有显著的影响。2)MIIP对肿瘤细胞调节血管生成能力的影响:分别收集并浓缩来自MIIP过表达或敲低MIIP表达水平的乳腺肿瘤细胞的条件培养基,进行总蛋白定量后,通过鸡胚尿囊膜血管生成实验(Chick Chorioallantoic Membrane Assay)、大鼠主动脉血管环实验(Rat aortic ring assay)观察上述条件培养基对血管生成能力的影响。结果显示,过表达MIIP的肿瘤细胞的条件培养基能抑制鸡胚尿囊膜血管生成反应及大鼠主动脉血管环的形成能力;反之,敲低MIIP表达水平的肿瘤细胞条件培养基能增强鸡胚尿囊膜血管生成反应及大鼠主动脉血管环的形成能力。随后,利用Western blotting实验,我们检测了上述条件培养基中VEGF-A、MMP2和MMP9的水平,结果显示,MIIP过表达的乳腺癌细胞的条件培养基中VEGF-A、MMP2和MMP9的水平降低,反之,在MIIP表达敲低的乳腺癌细胞条件培养基中,VEGF-A、MMP2和MMP9的水平升高。上述结果提示,MIIP可能通过抑制肿瘤细胞分泌、释放促血管生成因子,从而对肿瘤血管的生成起到抑制作用。3)MIIP对裸鼠种植瘤组织中CD31表达水平的影响:将MIIP过表达的乳腺癌细胞MDA-MB-231种植在裸鼠的乳腺脂肪垫上,约30天后取肿瘤组织切片后通过免疫组化检测CD31的表达情况。结果表明,在过表达MIIP的MDA-MB-231细胞所形成的肿瘤组织中,CD31的表达水平较低,提示MIIP对体内肿瘤血管生成可能具有抑制作用。4)MIIP抑制肿瘤血管生成的可能机制:通过Western blotting检测了过表达MIIP对HUVEC中VEGF-R2的表达水平、Erk1/2蛋白水平及磷酸化水平、FAK蛋白水平及磷酸化水平的影响。结果显示,MIIP可减弱HUVEC中VEGF-R2的表达、降低Erk1/2的磷酸化水平及FAKY-397及FAKY-925的磷酸化水平。同时,在乳腺癌细胞中过表达MIIP后,可抑制VEGF-A、HIF1α的表达水平。以上结果提示,MIIP可能通过降低内皮细胞上VEGF-R2的表达,进而影响HUVEC中的FAK和Erk1/2信号通路;以及抑制乳腺癌细胞中HIF1-α的表达从而降低VEGF-A的表达,实现其抗肿瘤血管生成的作用。结论:MIIP能抑制HUVEC的迁移、侵袭和成管能力;乳腺癌细胞中过表达MIIP后可抑制肿瘤细胞分泌和释放VEGF-A、MMP2和MMP9等促血管生成因子,由其所产生的条件培养基能够减弱鸡胚尿囊膜血管生成反应及大鼠主动脉血管环的形成能力。过表达MIIP的乳腺癌细胞形成的小鼠移植瘤组织中CD31的表达水平较低;MIIP可能通过抑制HUVEC中的FAK信号通路和Erk1/2信号通路、降低VEGF-R2的表达水平,以及抑制肿瘤细胞中HIF1-α、VEGF-A的表达水平起到抗肿瘤血管生成的作用。