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本课题首先研究了以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)WBL-3为发酵菌株,使用小型发酵罐生产聚γ-谷氨酸(Poly-L-glutamicacid,γ-PGA),并降解为小分子量γ-PGA,然后与壳寡糖(Chitooligosaccharide, CS)交联包覆于超顺磁性四氧化三铁(Fe3O4)表面,制备γ-PGA/CS/Fe3O4纳米粒子(PCN)。从西兰花的种子中提取及分离纯化抗癌活性物质莱菔硫烷(1-异硫氰酸-4-甲磺酰基丁烷,英文名Sulforaphane,SFN),制备了SFN/γ-PGA/CS/Fe3O4纳米粒子(PCSN),并研究了其对人肺癌A549细胞的治疗效果,最后对负载头孢氨苄(Cephalexin , CLX )和盐酸阿霉素(Doxorubicin , DOX )的CLX/γ-PGA/CS/Fe3O4纳米粒子(PCCN)、DOX/γ-PGA/CS/Fe3O4纳米粒子(PCDN)进行了研究。
首先将活化后的菌株WBL-3在摇瓶中进行培养,测量菌株生长曲线和γ-PGA产量曲线,确定进罐时间和发酵时间;进罐后继续测量生长曲线和产物曲线,监控菌株生长情况和产量趋势。收集粗产物,醇沉后使用透析袋去除小分子杂质,在pH为3.5、温度为120℃的条件下降解1.5h,得分子量在40-80KD范围内的小分子量γ-PGA。将CS与γ-PGA溶于水中,通过交联法将CS与γ-PGA这两种生物材料连接,包覆于Fe3O4表面制备出PCN。用透射电子显微镜(TEM)观察形貌,平均粒径为43nm左右;真空冷冻干燥后,用傅里叶红外光谱(FTIR)定性检测,表明CS的氨基和γ-PGA的羧基反应,成功交联。
使用高效液相色谱技术建立了SFN含量体外测定的方法。采用浸提法从西兰花种子中提取了SFN粗品,经硅胶柱分离出纯化制品。用HPLC分析SFN的含量,收集含有SFN的馏分,再用HPLC分析SFN的纯度。旋转蒸发后,真空冷冻干燥,用FTIR定性检测。结果表明提取物为SFN,纯度为87.50%,每克西兰花种子中SFN的提取得率为5.91mg。用提取纯化的SFN制备PCSN,平均粒径为75nm左右,载药量为30%左右,包封率为90%左右,可缓释72h以上,累积释放率为87.9%左右。然后采用MTT法检测PCSN对人肺癌细胞A549生长的影响;采用Transwell法检测PCSN对人肺癌细胞A549迁移和侵袭能力的影响。结果表明PCN无细胞毒性,PCSN可有效抑制A549细胞生长、迁移和侵袭。
最后通过体外缓释实验,探究PCN携带其他药物的能力。主要探究了负载CLX和DOX后的超顺磁性纳米粒子(PCCN, PCDN)的载药量,包封率和缓释能力。对于CLX,缓释能力较差,累积释放率为40%左右,而携带DOX,则表现出优良的缓释效果。
首先将活化后的菌株WBL-3在摇瓶中进行培养,测量菌株生长曲线和γ-PGA产量曲线,确定进罐时间和发酵时间;进罐后继续测量生长曲线和产物曲线,监控菌株生长情况和产量趋势。收集粗产物,醇沉后使用透析袋去除小分子杂质,在pH为3.5、温度为120℃的条件下降解1.5h,得分子量在40-80KD范围内的小分子量γ-PGA。将CS与γ-PGA溶于水中,通过交联法将CS与γ-PGA这两种生物材料连接,包覆于Fe3O4表面制备出PCN。用透射电子显微镜(TEM)观察形貌,平均粒径为43nm左右;真空冷冻干燥后,用傅里叶红外光谱(FTIR)定性检测,表明CS的氨基和γ-PGA的羧基反应,成功交联。
使用高效液相色谱技术建立了SFN含量体外测定的方法。采用浸提法从西兰花种子中提取了SFN粗品,经硅胶柱分离出纯化制品。用HPLC分析SFN的含量,收集含有SFN的馏分,再用HPLC分析SFN的纯度。旋转蒸发后,真空冷冻干燥,用FTIR定性检测。结果表明提取物为SFN,纯度为87.50%,每克西兰花种子中SFN的提取得率为5.91mg。用提取纯化的SFN制备PCSN,平均粒径为75nm左右,载药量为30%左右,包封率为90%左右,可缓释72h以上,累积释放率为87.9%左右。然后采用MTT法检测PCSN对人肺癌细胞A549生长的影响;采用Transwell法检测PCSN对人肺癌细胞A549迁移和侵袭能力的影响。结果表明PCN无细胞毒性,PCSN可有效抑制A549细胞生长、迁移和侵袭。
最后通过体外缓释实验,探究PCN携带其他药物的能力。主要探究了负载CLX和DOX后的超顺磁性纳米粒子(PCCN, PCDN)的载药量,包封率和缓释能力。对于CLX,缓释能力较差,累积释放率为40%左右,而携带DOX,则表现出优良的缓释效果。