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姜花（Hedychium coronarium）是姜科姜花属草本植物,白色花朵如蝴蝶,所以又名蝴蝶姜,花香味清新,多用于园林观赏和切花生产。其香气成分主要是萜类化合物和调苯节丙分烷子类,物通质常基筛因选从疑而似调以A控R花F6,香为是这物靶质基代2些0-2花2因谢的香个物碱。质基的长代度谢,m本iR研N究A首,并先根利据用受它到们多能种在因转素录的或诱转导录高mi通R量Ba测se序网结络果。数初据步后其水中库确及定姜了花平mi抑RN制A一靶转基是个小2录因组或的多R个N靶AA比RF对6¨g与miR167组合,PCR克隆了ARF6全长与miR167成熟序列;以不同发育进程姜花为研究对象,GC-MS测定其花香释放规律,荧光定量分析miR167与ARF6在姜花不同发育进程中的表达量,初步表明miR167与ARF6表达的相互关系及与姜花花香释放的关系;烟草共转确定了miR167与ARF6靶基因组合,STTM、病毒沉默、外源激素处理、亚细胞定位、双分子荧光互补等技术,研究了miR167与ARF6靶基因对花香代谢和萜类合成相关酶基因的调控机制,为探索姜花花香物质代谢的分子机理提供了新思路。本文取得的主要结果如下:1、根据ARF6序列比对筛选出了lus-miR167a、vvi-miR167c成熟序列最有可能为姜花中ARF6的上游作用miR167序列;姜花miRNA高通量测序以及Stem-loop反转法克隆证明了姜花中有与lus-miR167a、vvi-miR167c成熟序列相同的miR167,RT-PCR从姜花的花朵中克隆了ARF6基因的cDNA全长序列。2、HcARF6基因序列分析表明,cDNA的开放阅读框为2763bp,编码920个氨基酸,该氨基酸序列均含有B3（B3 DNA binding domain）、ARF（Auxin response factor）及CTD（C-terminal domain）保守结构域。系统进化分析表明,HcARF6与单子叶植物马来西亚野生香蕉的ARF17为一个亚族。同源性分析表明比对的不同物种的ARF6氨基酸序列都含有B3、ARF及CTD家族保守结构域,表明ARF6蛋白功能类似。3、GC-MS测定姜花发育进程中花香释放规律,结果表明姜花主要花香物质桉油醇、罗勒烯和沉香醇的挥发量随着花的开放不断增加,在花开后8h达到最高峰。qPCR分析了miR167与ARF6基因的表达规律,miR167的表达量在蕾期相对较高,盛开期间miR167的表达量持续维持在低水平状态,而ARF6表达量从开花前8小时开始增加,与花香释放的起始点基本一致。4、烟草共转化实验表明miR167可以结合ARF6并抑制其表达,及HcARF6是HcmiR167的靶基因。5、GUS染色实验表明pOx瞬时超表达体系适用于姜花。pOx-STTM（short tandem target mimic）瞬时超表达干扰miR167,与对照相比,miR167表达量下降了69%,ARF6表达量上升80%,花香物质沉香醇合成酶基因TPS1、TPS5和TPS8分别上升了201%、237%和41%,罗勒烯合成酶基因TPS3的相对表达量上升了78%,苯甲酸甲酯合成酶基因BSMT1上升了225%。花香挥发物质沉香醇上升了82%,苯甲酸甲酯上升了283%,达到极显著水平;别罗勒烯上升了42%,达到显著水平;桉油醇、罗勒烯也都分别上升了20%和30%。结果进一步表明了ARF6是miR167的靶基因,且miR167是姜花花香代谢的负调控因子。6、病毒沉默ARF6,与对照相比,ARF6的相对表达量下降了68%,花香物质沉香醇合成酶基因TPS1、TPS5和TPS8分别下降了35%、65%和39%,罗勒烯合成酶基因TPS3的相对表达量下降了72%,苯甲酸甲酯合成酶基因BSMT1下降了81%。花香挥发物质沉香醇下降了71%,罗勒烯下降了51%,苯甲酸甲酯下降了11%,桉油醇、别罗勒烯也都分别下降了53%和73%。与miR167作用相反,表明ARF6是姜花花香代谢的正调控因子。7、外源激素IAA处理姜花,与对照相比,罗勒烯上升47%、桉油醇上升56%,达到显著水平;沉香醇上升39%,苯甲酸甲酯、别罗勒烯也都分别上升了21%和49%。IAA处理后,ARF6的相对表达量上升了63%,miR167下降86%。激素处理后的姜花香气物质含量增多,且处理后的miR167和ARF6的相对含量变化与沉默miR167后的变化相一致,即miR167表达量上升,ARF6表达量下降,表明miR167、ARF6受外源IAA的调控,也进一步证明了ARF6作为miR167的靶基因两者相互拮抗调控姜花花香的合成释放。8、PEG4000介导的拟南芥原生质体亚细胞定位表明ARF6定位于细胞核。9、双分子荧光互补实验表明ARF6与PYL可以微弱互作,根据实验室前期研究,ABA受体蛋白PYL能与MYC2-1互作影响花香萜类物质代谢,推测miR167-ARF6可能通过PYL-MYC2-1途径调控姜花花香萜类物质代谢。10、烟草共同转化pOx-MYC2-1超表达载体和ARF6与PYL双分子荧光互补载体,实验表明MYC2-1蛋白能加强ARF6与PYL的互作,推测MYC2-1可能是ARF6和PYL互作的辅助因子,且三者能形成三元复合体一起调控姜花花香萜类物质代谢。