两栖类作为脊椎动物演化过程中由水生到陆生的过渡型,为适应复杂的生活环境,其皮肤进化出多种具有防御功能的多肽与蛋白：抗氧化多肽、具有心脏毒性、肌肉毒性、神经毒性等作用的多肽、抗菌肽等。抗菌肽作为先天免疫的重要组成部分,在获得性免疫被激活之前能够迅速地对感染做出反应,构成了抵抗微生物感染的第一道防线。因此,两栖类动物皮肤是具有巨大开发潜力的药物宝库。在本论文中,利用基因克隆的方法,我们从哥伦比亚角蛙皮肤中克隆得到一个255bp大小的抗菌肽cDNA序列,它编码84个氨基酸。通过信号肽预测以及序列比对发现,成熟肽含有63个氨基酸,命名为ceratoxin。在NCBI中经过blast比对发现,ceratoxin与从蛇毒腺中的waprins蛇毒素家族序列具有高度相似性,均含有四对二硫键。之前的研究结果已经证明,蛇毒腺中的waprin和kunitz-like毒素家族在进化中的同源性,其中kunitz-like毒素在两栖动物中已经发现,而与waprin毒素相似的蛋白并没有在两栖类动物中发现。通过构建表达载体对ceratoxin进行原核表达。将ceratoxin的编码基因导入pET32a+质粒,利用表达菌株BL21(DE3)进行诱导表达。表达后的菌体经超声破碎、Ni2+亲和层析、肠激酶切割从而将ceratoxin从融合蛋白中释放出来。随后用快速液相色谱及反向高压液相色谱对ceratoxin进行分离纯化,并用聚丙烯凝胶电泳对目的蛋白进行跟踪检测,达到电泳纯时,经过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)测定表达后的ceratoxin分子量为6996.1,与预测分子量基本相同,得到纯度>95%的ceratoxin。对caratoxin可能具有的生物学活性进行了研究。通过抑菌圈法以及最小抑菌浓度的测定,发现重组ceratoxin对革兰氏阳性菌以及真菌均具有较强的抑菌活性,其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌以及枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度分别为：1.5,>250,5.9和5.9pg/ml。Ceratoxin的抑菌活性与蛇waprin家族相同,这一结果表明,在两栖类动物中也存在与waprin家族相似的且具有抗菌活性的蛋白,且可能在先天性免疫中发挥着重要作用,这一发现对于研究两栖类和爬行的进化关系具有重大的意义。通过构建由金黄色葡萄球菌诱导的小鼠结膜炎模型,证明了ceratoxin在体内也能有效的杀死金黄色葡萄球菌,对于治疗结膜炎有较好的效果。对ceratoxin体内代谢动力学的研究发现,ceratoxin在体内经过6小时即可代谢完全,半衰期短,这样就避免了药物长期停留在体内,对身体造成伤害。这一研究为ceratoxin在临床上的应用提供了科学依据。