[背景]肝纤维化常继发于各种形式的慢性肝损伤,是各种慢性肝病发展的病理过程,开发有效的防治肝纤维化的药物仍是困扰医学界的难题。肝纤维化病理过程中的核心环节就是肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)的活化,进而大量地分泌细胞外基质(extracellular matrix, ECM)。ECM的过度沉积会导致肝功能损伤,如无有效治疗,最终将有发展为肝硬化及肝癌的可能。目前还没有药物被FDA批准用于抗肝纤维化的治疗,新药的研发成本较高,时间久,那么从现有的安全性明确且已被广泛应用于临床治疗其他疾病的药物中挖掘其抗肝纤维化作用是本次研究的出发点。我国药学工作者从中药黄花蒿叶中提取分离得出的一种倍半萜内酯类化合物：青蒿素,其化学结构经过改造、修饰,先后发展了青蒿琥酯、蒿甲醚、双氢青蒿素(Dihydroartemisinin, DHA)等多种衍生物。DHA是青蒿素及其衍生物蒿甲醚和青蒿琥酯在体内的有效活性代谢产物。最新研究发现,青蒿素的衍生物青蒿琥酯具有一定的抗肝纤维化作用,但目前国内外未有涉及DHA抗肝纤维化的研究报导。基于以上的研究,考虑到DHA是青蒿素及其衍生物在体内的有效活性代谢产物。本论文选择DHA,并探究其抗肝纤维化的作用及具体的作用机制。[研究方法]本论文主要围绕体内、体外两部分实验进行展开。1)体内研究部分：本研究采用胆管结扎(bile duct ligated, BDL)诱导大鼠肝纤维化模型,DHA不同浓度(3.5、7、14mg/kg)及阳性对照药物秋水仙碱(0.1mg/kg)干预处理,末次给药24h后,取血清检测丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、胆红素(Bilirubin);取肝组织和血清检测羟脯氨酸(hydroxyproline, Hyp)水平；HE染色、马松染色和天狼猩红染色检测肝组织病理切片；免疫荧光及Western blot检测肝组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、α1(Ⅰ)型前胶原(α1(Ⅰ)Procollagen)、纤连蛋白(Fibronectin)等与HSC活化有关的指标：同时采用试剂盒检测透明质酸(Hyaluronic acid, HA)、层黏连蛋白(Laminin, LN)、Ⅲ型前胶原(ProcollagenⅢ、PCⅢ)等肝纤维化指标：利用免疫荧光探究DHA对活化HSC凋亡的影响2)体外研究部分：首先运用MTT法、LDH法以及AST、ALT试剂盒考查DHA体外对人正常LO2肝细胞的影响；通过MTT、LDH法考察不同浓度DHA对HSC的毒性,以选择对HSC无毒性的DHA剂量作为接下来的用药浓度；采用Hoechst33258染色、流式细胞术和Western blot考查DHA对HSC细胞周期和凋亡的影响；最后考察DHA诱导活化HSC凋亡的分子机制。[研究结果]1、肉眼观察肝脏,发现BDL组的肝脏表面颜色发黄,触感粗糙,质地变硬,且有许多颗粒状物质；HE染色结果显示,模型组的SD大鼠肝脏组织肝小叶的结构完全被破坏,大量炎性细胞浸润,纤维增生弥散,给予低(3.5mg/kg)、中(7mg/kg)、高(14mg/kg)剂量组DHA治疗后,发现其肝脏组织结构得到明显改善；血清生化指标结果显示,模型组SD大鼠血清中的ALP、ALT、AST、Bilirubin含量显著升高,DHA能降低血清中ALP、ALT、 AST、Bilirubin水平,并表现出剂量依赖性：ELISA结果显示,不同剂量的DHA剂量依赖性地降低大鼠肝脏及血清中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白介素-6(interleukin-6,IL-6)的升高。这些结果提示DHA对BDL引起的肝损伤有显著的保护作用。2、马松染色、天狼猩红染色及Hyp含量检测显示,BDL诱导肝脏出现大量胶原纤维沉积,组织和血清中的Hyp含量显著上升,而不同剂量的DHA可明显地抑制胶原纤维的生成,降低Hyp水平；试剂盒检测HA、LN、PCⅢ在肝脏及血清中的水平,结果显示模型组SD大鼠的纤维指标明显升高,DHA能够降低这些因子的表达,并表现出一定的剂量依赖性；免疫荧光染色、Western blot结果显示,不同剂量的DHA剂量依赖性地抑制BDL诱导的与HSC活化有关的指标如α-SMA、α1(I)Procollagen、Fibronectin等的升高,表明DHA能通过抑制HSC的活化,发挥抗肝纤维化的作用；DHA可促进活化HSC表面的Cleaved-Caspase-3的表达,诱导活化HSC的凋亡。3、体外MTT法、LDH法和AST, ALT试剂盒实验结果显示,DHA体外对肝细胞没有明显毒性作用；Western blot及免疫荧光实验结果显示,DHA剂量依赖性地抑制HSC的增殖和活化；流式细胞仪分析、Hoechst33258染色、线粒体膜电位试剂盒检测(JC-1)及Western blot检测显示,DHA使HSC阻滞在S期,并能诱导HSC发生线粒体凋亡。4、Western blot结果显示药物DHA诱导HSC凋亡与PI3K/Akt信号通路相关。通过加入表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)诱导P13K的磷酸化和P13K的抑制剂LY294002,明确PI3K/Akt信号通路与DHA诱导HSC凋亡的作用关系。5、Western blot结果显示DHA能抑制纤维化标志物的表达,抑制HSC的活化。[结论和意义]体内研究显示DHA具有显著抗炎症和抗肝纤维化作用；体外研究显示,DHA的这一作用主要与其抑制HSC活化及诱导其凋亡的能力有关。进一步的研究表明DHA可能是通过介导PI3K/Akt信号转导通路来发挥诱导HSC凋亡的作用。本论文的研究结果为抗肝纤维化的药物研发提供了一个新的视角。DHA很有可能成为临床防治肝纤维化的药物。