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甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤,其中约5%-10%左右为来源于滤泡旁细胞的甲状腺髓样癌(Medullary Thyroid Carcinoma,MTC)。MTC的恶性程度介于分化型甲状腺癌与未分化癌之间,具有恶性程度较高、病情进展较快、术后易复发等特点。据统计,50%-80%MTC的首发临床表现包括颈部转移性淋巴结肿大;对于临床确诊的MTC,约有超过20%存在远处转移。目前,手术切除仍是临床MTC的首选治疗方式,但术后复发率及患者的远期生存率并未得到较大的提高,并且,多数患者在术后复发时病情较重,已丧失手术治疗机会。而放射性碘治疗对MTC无治疗作用,放疗及化疗等效果均不佳。近几年来出现的分子靶向治疗、肿瘤疫苗、单克隆抗体、自杀基因或免疫基因治疗等各种生物免疫治疗方法,已经在临床上或临床前试验中取得了一定的疗效,但效果并不理想。因此,我们需为甲状腺髓样癌的治疗寻找一种更加有效的治疗措施。抗菌肽(AMPs)是广泛存在于微生物、植物和动物中的天然多肽,并且被认为是先天性免疫的必要组成成分。抗菌肽具有广泛的生物活性,如抗细菌、抗真菌、抗病毒等。最新研究显示,阳离子抗菌肽可以选择性杀伤肿瘤细胞,而对正常哺乳动物细胞无害,使其成为近期研究热点。但抗菌肽对甲状腺癌的抗肿瘤效果如何,未见相关报道。本研究选取抗菌肽中具有明显抗肿瘤作用的牛骨髓抗菌肽-28(BMAP-28)及蜂毒肽(Melittin),通过体内和体外实验检测了他们对甲状腺髓样癌的抗肿瘤效果,取得以下结果:1 BMAP-28对人甲状腺髓样癌细胞系TT体内外均具有明显抗肿瘤活性1.1 BMAP-28体外能够显著抑制TT细胞的生长,并且呈剂量依赖和时间依赖关系。AV-PI双染细胞凋亡实验表明,多肽BMAP-28能够诱导TT细胞的凋亡作用,在BMAP-28浓度为1、2、4μM时,TT细胞的凋亡率分别为6.51%、14.63、15.32%。机理研究显示BMAP-28能够上调TT细胞内caspase-3及caspase-9蛋白表达并提高二者的m RNA水平。此外,对BMAP-28作用后TT细胞内促进肿瘤侵袭与转移相关的MMP-3和MMP-9的检测结果显示,BMAP-28抑制TT细胞MMP-3和MMP-9蛋白的转录和翻译。1.2 BMAP-28体内能够显著抑制甲状腺髓样癌细胞系TT裸鼠皮下移植瘤的生长。模型组移植瘤的体积随时间的延长而增加,多肽BMAP-28高中低剂量组(1mg/kg、0.50 mg/kg、0.25mg/kg)的瘤体积与模型组相比明显较小。与模型组相比,多肽BMAP-28给药组的瘤重剂量依赖性下调,BMAP-28 0.25、0.5、1mg/kg三个剂量组的抑瘤率为30%、34.29%、55.71%。BMAP-28能够显著抑制TT细胞裸鼠皮下移植瘤的生长,体内抗肿瘤活性明显。2 Melittin体外显著抑制TT细胞的生长,其改造体TT-1与Melittin相比极大的节约了成本,提高了稳定性,降低了毒性。2.1不同剂量(0,0.5,1,2,4,8,16,32μM)的Melittin与TT细胞作用48h后,MTT检测细胞活率显示Melittin显著抑制TT细胞的生长,与BMAP-28组比,Melittin抑制TT细胞生长更明显。2.2因抗菌肽具有产量低,成本高及稳定性较差的特点,限制了其进一步的应用。因此,我们对上述试验中对抗TT细胞活性较好的Melittin进行改造,在Melittin已知分子结构特征的基础上,利用生物信息学手段,设计得到仅含11个氨基酸的新抗菌肽TT-1,相较其母肽极大的节约了成本。改造体TT-1不仅保留了Melittin氨基末端区域的活性位点,并将原有不稳定的氨基酸脯氨酸替换为带有正电荷的赖氨酸,TT-1的疏水距与疏水性均增加,提示他的活性增强,稳定性增加;TT-1的电荷比Melittin有所减少,意味着它的毒性会有所降低。3 TT-1对人甲状腺髓样癌细胞系TT体内外均具有明显抗肿瘤活性3.1 TT-1对人正常甲状腺细胞Nthy-ori3-1无明显的细胞毒作用,但能够特异性的杀伤TT细胞。AV-PI双染实验结果表明,TT-1体外可诱导TT的凋亡。对TT-1作用后TT细胞内凋亡相关的caspase-3、caspase-9、Bax和Bcl-2转录和翻译水平的表达进行检测,结果表明,TT-1激活促凋亡蛋白caspase-3、caspase-9、Bax并下调抑制凋亡蛋白Bcl-2。3.2 TT-1显著抑制人甲状腺髓样癌细胞系TT裸鼠皮下移植瘤的生长。模型组移植瘤的肿瘤体积随时间的延长而增加,TT-1高、中剂量组(1mg/kg、0.2mg/kg)的瘤体积与模型组相比明显较小。TT-1低剂量组(0.04mg/kg)的瘤体积与模型组相当。多肽TT-1高、中剂量组(1mg/kg、0.2 mg/kg)的瘤质量与模型组相比明显较小,且具有显著性差异(**P<0.01)。TT-1三个剂量组1mg/kg、0.2mg/kg、0.04mg/kg对应的抑瘤率为56.8%、48.6%、5.8%。综上所述,本论文首创性地研究了阳离子抗菌肽BMAP-28、Melittin对人甲状腺髓样癌细胞系TT的抗肿瘤活性。通过体内外试验研究,阐述了BMAP-28抗甲状腺髓样癌的作用机理,并证实其作用效果。体外实验证实Melittin抑制TT细胞的生长较BMAP-28更明显。同时,通过对Melittin的改良设计得到同样具有抗TT细胞活性的新型阳离子抗菌肽TT-1,不仅节约了成本,提高稳定性,而且还降低了毒性,为甲状腺髓样癌的治疗策略提供了新的方向。