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缺血性脑卒中发病率逐年攀升,发病人群已经出现年轻化趋势,严重影响着我国居民身体健康和生活质量。目前,溶栓疗法是缺血性脑卒中的首选治疗方法,由于溶栓后缺血血管的血流再灌注,使脑组织损伤程度进一步加重,产生新的病理损伤,即脑缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）损伤。脑I/R损伤引起的神经细胞死亡方式,主要以细胞凋亡为主,它主要发生在缺血病灶周围的缺血半影区,并且脑I/R损伤的严重程度与细胞凋亡有着直接关系。线粒体凋亡通路（mitochondrial apoptotic pathway）是细胞凋亡的主要方式之一,Cyt C/Apaf-1是线粒体凋亡通路中的重要经典途径,对于调节细胞凋亡和维持线粒体功能稳定发挥着关键作用。中药黄芪具有补气活血之功效,被历代医家用来治疗缺血性脑卒中,并取得良好效果。毛蕊异黄酮（calycosin）是黄芪黄酮类的有效单体成分,研究发现毛蕊异黄酮具有抗氧化、抗炎、抗病毒、保肝、延缓衰老等生物作用。而毛蕊异黄酮是否具有抑制脑I/R损伤的作用?其是否可通过抑制细胞凋亡,甚至通过调控Cyt C/Apaf-1线粒体凋亡通路,从而拮抗脑I/R损伤,发挥神经保护作用?尚缺乏研究。因此,本研究通过建立缺氧缺糖/复氧复糖（oxygen and glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R）PC12细胞模型,模拟神经元体外I/R损伤环境,探讨毛蕊异黄酮是否可通过Cyt C/Apaf-1线粒体凋亡通路抑制细胞凋亡,发挥对缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞的保护作用。本研究以PC12细胞为实验对象,通过离体细胞实验模拟脑I/R损伤过程。研究共分为三个部分:1、观察毛蕊异黄酮对缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞损伤的影响;2、探讨毛蕊异黄酮对缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞凋亡的影响;3、研究毛蕊异黄酮对缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞Cyt C/Apaf-1线粒体凋亡通路的影响。第一部分毛蕊异黄酮对缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞损伤的影响目的:观察毛蕊异黄酮对缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞损伤的影响。方法:将对数生长期PC12细胞随机分为5组:正常对照组（Control）、缺氧缺糖/复氧复糖组（Model）、毛蕊异黄酮高、中、低（Calycosin,0.140μmol/L、0.070μmol/L、0.035μmol/L）剂量组。除Control组外,其余各组进行缺氧缺糖2h复氧复糖24h造模处理。Calycosin不同剂量组在复氧复糖的同时分别给予含有毛蕊异黄酮（0.140μmol/L、0.070μmol/L、0.035μmol/L）的含药培养基处理。用倒置显微镜观察细胞形态变化;CCK-8检测细胞活力;LDH检测细胞乳酸脱氢酶漏出率;PI荧光染色检测细胞膜完整性。结果:Control组细胞生长状态良好;与Control组相比,Model组细胞数量减少,细胞折光性降低,突触减少,细胞形态干瘪出现皱缩,胞膜破损,细胞活性显著降低（P﹤0.05）,乳酸脱氢酶漏出率显著升高（P﹤0.05）,PI红染细胞数增多（P﹤0.05）;与Model组相比,Calycosin中、低剂量组细胞数量均增多,突触增多,胞体变圆,细胞较为规整,折光性明显提高,细胞活性显著提高（P﹤0.05）,乳酸脱氢酶漏出率显著降低（P﹤0.05）,PI红染细胞数减少（P﹤0.05）,且以上指标中剂量组效果更加显著;而高剂量组与模型组相比,以上指标差异均不明显（P>0.05）。小结:毛蕊异黄酮可优化缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞生长状态,提高细胞活力,抑制乳酸脱氢酶漏出,有效减轻细胞膜损伤,发挥保护作用,且毛蕊异黄酮中剂量组（0.070μmol/L）作用效果最为显著,将应用于第二、三部分实验。第二部分毛蕊异黄酮对缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞凋亡的影响目的:探讨毛蕊异黄酮对缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞凋亡的影响。方法:将对数生长期PC12细胞随机分为4组:正常对照组（Control）、模型组（Model）、毛蕊异黄酮组（Calycosin,0.07μmol/L）和尼莫地平组（Nimodipine,5.00μmol/L,阳性对照药组）。造模方法同第一部分,Calycosin组和Nimodipine组在复氧复糖的同时分别给予含有毛蕊异黄酮（0.07μmol/L）和尼莫地平（5.00μmol/L）的含药培养基处理。缺氧缺糖2h后复氧复糖24h,用流式细胞术和TUNEL染色检测细胞凋亡率和凋亡指数;免疫荧光染色检测细胞Bax/Bcl-2比值;免疫组化检测caspase-3蛋白表达。结果:与Control组相比,Model组细胞凋亡率和凋亡指数显著升高（P<0.05）,Bax/Bcl-2比值上调（P<0.05）,caspase-3蛋白表达显著升高（P<0.05）;与Model组相比,Calycosin组和Nimodipine组细胞凋亡率和凋亡指数均明显降低（P<0.05）,Bax/Bcl-2比值明显下调（P<0.05）,caspase-3蛋白表达明显降低（P<0.05）,差异有统计学意义。小结:毛蕊异黄酮可明显降低缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞凋亡率和凋亡指数,下调细胞Bax/Bcl-2比值,降低凋亡蛋白caspase-3表达,通过抑制细胞凋亡发挥对缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞的保护作用。第三部分毛蕊异黄酮对缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞Cyt C/Apaf-1线粒体凋亡通路的影响目的:研究毛蕊异黄酮对缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞Cyt C/Apaf-1线粒体凋亡通路的影响。方法:（1）首先采用基因沉默方法,明确线粒体凋亡通路核心蛋白Apaf-1在缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞特殊模型中调控细胞凋亡的关键作用,实验分为正常对照组（Control）、模型组（Model）和Apaf-1基因沉默组（Apaf-1-si RNA）,造模方法同第二部分,Apaf-1-si RNA组于造模前将化学合成的si RNA通过脂质体转染到PC12细胞内,靶向沉默Apaf-1基因。分别用荧光标记的si RNA和Western blot检测Apaf-1的转染效率;随后用流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blot检测各组细胞Apaf-1蛋白表达。（2）探讨毛蕊异黄酮对缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞Cyt C/Apaf-1线粒体凋亡通路的影响,实验分为正常对照组（Control）、模型组（Model）和毛蕊异黄酮组（Calycosin,0.07μmol/L）,用Western blot检测线粒体凋亡通路关键蛋白Cyt C、Apaf-1、caspase-9和caspase-3表达。结果:（1）Apaf-1-si RNA能有效沉默PC12细胞中Apaf-1蛋白表达（P<0.05）,Apaf-1-si RNA组与Model组比较可见细胞凋亡率明显降低（P<0.05）,Apaf-1蛋白表达明显降低（P<0.05）,表明靶向沉默Apaf-1基因可有效抑制缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞凋亡,明确了Apaf-1在缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞特殊模型中调控细胞凋亡的关键作用。（2）观察毛蕊异黄酮对Cyt C/Apaf-1线粒体凋亡通路的影响,与Control组相比,Model组线粒体凋亡通路关键蛋白Cyt C、Apaf-1、caspase-9和caspase-3的表达均明显升高（P<0.05）,与Model组相比,Calycosin组线粒体凋亡通路关键蛋白Cyt C、Apaf-1、caspase-9和caspase-3的表达均明显降低（P<0.05）,差异有统计学意义。小结:毛蕊异黄酮抑制缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞凋亡的作用机制与其调控Cyt C/Apaf-1线粒体凋亡通路,抑制线粒体凋亡通路关键蛋白Cyt C、Apaf-1、caspase-9和caspase-3表达密切相关。结论:1.毛蕊异黄酮可明显改善缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞生长状态,提高细胞活力,抑制乳酸脱氢酶漏出,保护细胞膜完整性,有效减轻缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞损伤,发挥保护作用。2.毛蕊异黄酮可显著降低缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞凋亡率及调亡指数,降低细胞Bax/Bcl-2比值,降低caspase-3蛋白表达,通过抑制细胞凋亡发挥对缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞的保护作用。3.毛蕊异黄酮抑制缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞凋亡的作用机制与其调控Cyt C/Apaf-1线粒体凋亡通路,抑制线粒体凋亡通路关键蛋白Cyt C、Apaf-1、caspase-9和caspase-3表达密切相关。