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猪圆环病毒(PCV)属于圆环病毒科(Circoviridae),圆环病毒属(Circovirus),是已知最小的动物病毒。其于20世纪70年代在培养的PK-15细胞中被发现,随后在加拿大大量爆发称为断奶仔猪多系统衰竭综合征(Post-weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的猪体内检测到了PCV。后将具有致病性的PCV命名为PCV2,而将无致病力的PCV命名为PCV1。目前PCV2感染已经蔓延至世界各地养猪场,给世界各国养猪业带来巨大的经济损失。现阶段对于PCV2复制相关蛋白Rep参与病毒滚环复制的机制研究还不够深入,比如Rep蛋白是否以多聚体形式行使在滚环复制中的功能、Rep蛋白间相互作用的关键性位点等许多关键性问题还未阐释清楚。因此探究Rep蛋白间相互作用的关键位点以及解析Rep全长蛋白的空间结构能够为发现PCV Rep蛋白新的功能结构域、进一步阐释滚环复制机制从而开发针对PCV2高效疫苗和治疗新药物奠定更为扎实的基础。根据本实验室前期研究结果,推测Rep蛋白第107位半胱氨酸、第35位亮氨酸及第37位异亮氨酸可能对Rep蛋白二聚体的形成具有关键作用。本研究通过突变Rep蛋白第107位半胱氨酸、第35位亮氨酸以及第37位异亮氨酸在真核及原核表达系统中检测突变体对蛋白多聚化的影响,在PCV2复制子上验证突变对复制子复制率、海肾荧光素酶活性的影响以及突变对蛋白解旋酶活性的影响,并尝试对Rep全长蛋白进行晶体的初步筛选。研究的内容及结果如下:(1)PCV2 Rep融合蛋白的表达纯化以及融合标签的切除将扩增出的PCV2 Rep基因连接至pET28a-SUMO原核表达载体后转化至BL21(DE3)感受态细胞经诱导表达,利用Ni2+亲和层析成功纯化出SUMO-Rep融合蛋白。将纯化出的SUMO-Rep融合蛋白用SUMO蛋白酶于4℃条件切割2 h能够完全去除SUMO标签。(2)Rep全长蛋白及其突变体的多聚化检测成功构建pcDNA3.1-Rep、pcDNA3.1-Rep-C107A、pcDNA3.1-Rep-L35A-I37AC107A真核表达质粒并转染293T细胞进行非还原SDS-PAGE,结果表明在非还原变性条件下真核表达的野生型及突变体蛋白均未见二聚体及更高聚体形式而仅见蛋白单体形式。将原核表达纯化后去除SUMO标签的野生型以及C107A、L35A-I37A-C107A突变体Rep蛋白用分子筛验证蛋白多聚化。结果表明PCV2 Rep全长蛋白C107A突变体的多聚化与野生型蛋白相似,而L35A-I37A-C107A突变体蛋白的多聚化受到影响。说明第107位半胱氨酸并不是Rep全长蛋白形成分子间二硫键从而形成多聚体的关键性位点,而第35位亮氨酸、第37位异亮氨酸参与了Rep全长蛋白间的相互作用。(3)基于Rep基因复制子突变体的构建以及复制子复制率、海肾荧光素酶活性的检测根据本实验室构建PCV2复制子的流程,成功构建Rep基因C107A以及L35AI37A-C107A复制子突变体。将复制子突变体转染PK-15细胞后采用Realtime-PCR方法检测复制子复制率,用Renilla Luciferase Assay System试剂盒检测海肾荧光素酶活性。结果表明C107A突变体复制子的复制率及海肾荧光素酶活性较野生型复制子高,而L35A-I37A-C107A突变体复制子复制率及海肾荧光素酶活性较野生型严重降低,与非复制子的复制率及海肾荧光素酶活性相当。(4)Rep全长蛋白突变体解旋酶活性的检测通过非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳检测Rep全长蛋白及其突变体解旋酶活性。结果表明C107A突变体蛋白以及L35A-I37A-C107A突变体蛋白的解旋酶活性与野生型Rep蛋白的解旋酶活性相比并无明显差异。(5)PCV2 Rep全长蛋白晶体的初步筛选将切除SUMO标签的Rep蛋白通过分子筛进一步纯化并浓缩后,采用座滴扩散的方法对实验室保存的5个晶体筛选试剂盒共480种条件进行了初步筛选。但遗憾的是经过尝试各种条件仍无法生长出蛋白晶体。