目前，高光学纯度的D-乳酸因其在合成耐热性更高，机械强度更好的聚乳酸材料方面的实际应用极大地带动了D-乳酸的生产研究。菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus）是典型的同型发酵D-乳酸优势菌株，但目前鲜有其分子水平代谢特性的报道，阻碍了对菌株的理性代谢调控和基因工程改造。本论文对S.inulinus产D-乳酸过程中的关键限速步骤的调控机制进行了研究。在发酵过程中，葡萄糖经依赖于跨膜质子动力势能的糖转运蛋白运至胞内，随后被快速诱导的葡萄糖激酶磷酸化并进入糖酵解途径，代谢效应物通过复杂的别构调控机制控制磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的酶活力，进而控制糖酵解代谢流和D-乳酸生产，最后，通过小分子扰动反馈调控D-乳酸生产。本研究为S.inulinus发酵产D-乳酸的代谢调控和高性能基因工程菌的构建奠定理论基础。内容摘要如下:　　1.菊糖芽孢乳杆菌同型发酵D-乳酸过程中，葡萄糖的转运及其磷酸化是代谢途径中的第一个关键限速步骤。S.inulinus Y2-8在葡萄糖发酵过程中，细胞处于高糖和低pH的特殊环境中，但胞内pH仍维持在6.3-6.5之间。这导致细胞内外形成了1.3-1.5个pH的巨大质子浓度梯度，胞外的质子浓度几乎是胞内质子浓度的20-30倍，其产生的质子驱动力极其有利于葡萄糖转运蛋白对葡萄糖的吸收，随后被胞内快速诱导的葡萄糖激酶(GLK)磷酸化。因此，在S.inulinus发酵葡萄糖产D-乳酸过程中，葡萄糖转运蛋白和GLK在葡萄糖吸收和快速转化为磷酸化形式中发挥着最重要的作用，而不是PTS。　　2.葡萄糖激酶是糖酵解途径的第一个限速酶，在磷酸化葡萄糖过程中发挥着最重要的作用。实现S.inulinus Y2-8的GLK基因的ORF为975 bp，编码324个氨基酸，以pET-28a为载体，实现其在大肠杆菌中的异源表达。通过SDS-PAGE和凝胶过滤层析显示，该酶是亚基分子量为35 kDa的同源二聚体。GLK酶活力依赖于金属离子的催化，Mg2+为最佳，且大部分的二价金属离子都可以一定程度催化该反应。ADP是底物ATP的竞争性抑制剂。GLK酶活严格依赖于ATP为磷酸基供体，但除葡萄糖以外，该酶还能磷酸化多种六碳糖及其衍生物，显示出独特的宽泛底物特异性，与目前已报道的细菌来源的GLKs的专一的底物特异性相异。这种宽泛的底物适应性将为扩宽其发酵生产原料提供理论依据。　　3.磷酸果糖激酶(PFK)是糖酵解途径中的限速别构酶，糖酵解的速率也严格依赖于该酶的活力。S.inulinus Y2-8的PFK基因长960 bp，编码319个氨基酸，以pSE380为载体，通过低温诱导实现其在大肠杆菌中的可溶性表达。纯化的PFK经SDS-PAGE和凝胶过滤层析显示为亚基分子量为34 kDa的同源四聚体。该PFK的酶活严格依赖于磷酸基供体ATP和二价金属离子（Mg2+、Md+或Co2+）的催化。一价金属离子Na+可以激活该酶，同时可以促进增加糖酵解代谢流，增加D-乳酸产量。激活剂GDP和ADP可以提高该PFK对底物果糖-6-磷酸的亲和力。PEP是该PFK的强烈抑制剂，大幅降低酶活力和酶对底物果糖-6-磷酸的亲和力，但添加激活剂GDP或ADP可以有效减弱PEP对该酶的抑制作用。在细胞生理水平，PEP、GDP和ADP共同参与PFK酶活力的调控，从而控制糖酵解代谢流和D-乳酸生产。　　4.丙酮酸激酶(PYK)是糖酵解的最后一步不可逆反应，其产物丙酮酸直接参与D-乳酸的合成。实现S.inulinus Y2-8的PYK基因的克隆和在大肠杆菌中的异源表达。纯化的PYK是亚基表观分子量为59 kDa的同源四聚体(218 kDa)。S.inulinus的PYK的酶活严格依赖于二价金属离子和一价离子的催化，其中Mn2+和K+分别为最佳。与大多数的已报道的PYKs相异，该PYK表现出新颖的Mn2+激活效应，其依赖Mn2+的催化效率和对底物的亲和力均大大高于Mg2+和Co2+。结合圆二色谱分析表明，Mn2+可以显著改变该PYK的构象，推测Mn2+是该PYK的别构激活剂。该PYK的酶活受到核糖-5-磷酸和AMP的激活，同时受到葡萄糖-6-磷酸、柠檬酸、无机磷和ATP的抑制。但这种抑制作用可以随激活剂的添加显著减弱或消除。同时，在S.inulinus发酵产D-乳酸过程中，抑制剂对该PYK的抑制可由其pH值降低而轻微减弱。基于PYK的别构效应，通过小分子扰动反馈指导发酵过程，实验证实，微量的Mn2+既可加快糖酵解代谢流，提高D-乳酸产量，而胞外无机磷含量则显著抑制细胞生长和降低D-乳酸产量，因而发酵过程需要严格控制无机磷含量。关键酶的别构调控机制的研究将为S.inulinus发酵产D-乳酸的代谢调控和高性能基因工程菌提供指导。