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本研究目的在于揭示与奶牛耐热性状相关候选基因的分子遗传机理,为标记辅助选择耐热性奶牛新品系提供基础资料。通过研究不同季节条件下奶牛部分生理指标、生化指标及产奶性状指标的变化规律；利用实时荧光定量PcR分析奶牛外周血淋巴细胞HSP70、ATP1A1、SOD3和GPX3基因mRNA表达水平与耐热指标的相关性,确定奶牛耐热性状的候选基因；选择牛遗传图谱上分别与耐热性状相关候选基因及影响产奶量和乳组成QTL连锁的7个微卫星标记,分析在奶牛样本群体的遗传参数,并运用最小二乘拟合一般线性模型与奶牛的耐热指标进行关联分析；采用PCR-LIS-SSCP和DNA测序技术检测奶牛耐热性状候选基因ATP1A1基因的SNPs,并研究了其多态性和奶牛耐热性状的关系。结果如下：1热应激对奶牛部分生理生化指标及产奶性状的影响为了研究不同季节条件下奶牛的部分生理指标、血液无机离子含量、红细胞膜Na+,K+一ATP酶活性、血液抗氧化指标和产奶性状的变化规律,选择3-5胎次的80头健康荷斯坦奶牛,根据夏季直肠温度和产奶量下降率两个指标分为耐热组(直肠温度在37.5-39.5℃之间,产奶量下降率<10%)和非耐热组(直肠温度>39.5℃,产奶量下降率>40%),分别于夏季8月份(牛舍日平均气温为32.5℃,THI为84.16)和同年秋季11月份(牛舍日平均气温为12.5℃,THI为56.80)条件下,测定直肠温度、耐热系数、呼吸频率、血液无机离子含量、血清SOD酶活、血清GSH-px酶活、血清MDA含量、红细胞膜Na+,K+-ATP酶活性及产奶性状等指标,结果表明：热应激对奶牛的部分生理、生化指标及产奶性状影响程度很大,导致直肠温度升高,呼吸频率增加,血清Na+和红细胞钾含量下降,红细胞膜Na+,K+-ATP酶活性下降,抗氧化能力受到损伤,产奶量下降和体细胞评分增高等,其中,直肠温度、耐热系数、红细胞钾含量、红细胞膜Na+,K+-ATP酶活、血清SOD酶活、血清GSH-px酶活、日产奶量在夏季耐热组与非耐热组间差异显著(P<0.05),表明其与奶牛耐热性关系密切,可以作为选育耐热性奶牛新品系和监测热应激程度的参考指标。2奶牛HSP70、ATP1A1、SOD3和GPX3基因mRNA表达水平与耐热性关系的研究为了研究奶牛HSP70、ATP1A1、SOD3和GPX3基因mRNA表达水平与耐热性的相关性,确定奶牛耐热性状的候选基因,为揭示奶牛耐热性状分子遗传机理提供参考。选取16头3胎次的高产健康荷斯坦奶牛,分为耐热组和非耐热组,分别于夏季8月份(牛舍日平均气温为32.5℃,THI为84.16)和同年秋季11月份(牛舍日平均气温为12.5℃,THI为56.80)条件下,采集奶牛尾静脉血液,并测定夏季直肠温度、产奶量下降率和红细胞钾含量作为耐热指标；应用RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR技术分析不同温度条件和不同组别奶牛外周血淋巴细胞HSP70、ATP1A1、SOD3和GPX3基因mRNA表达水平的差异及其与奶牛耐热性状的关系。结果表明：与秋季相比,夏季奶牛HSP70、ATP1A1和GP.X3的]mRNA表达水平极显著上升(P<0.01), SOD3mRNA表达水平显著提高(P<0.05)；夏季高温期间,耐热组的ATP1A1和SO1D3基因的mRNA表达水平极显著高于非耐热组(P<0.01),GPX3 mRNA表达水平显著高于非耐热组(P<0.05),而HSP70mRNA表达水平在二组别间差异不显著(P>0.05)。相关分析表明奶牛外周血淋巴细胞四个基因mRNA表达水平与部分耐热指标呈显著相关(P<0.05)。因此,可以得出HSP70、ATP1A1、SOD3和GPX3参与了热应激过程中分子水平上的表达调控,可能对奶牛耐热性起作用,可作为影响奶牛耐热性状的候选基因进一步研究。3奶牛微卫星标记与耐热性状的相关分析为了探讨微卫星DNA作为奶牛耐热性状遗传标记的可行性。根据牛基因组遗传图谱,选择奶牛不同染色体上分别与HSP70、ATP1A1、SOD、GPX3基因和影响产奶量和乳组成的QTL连锁的微卫星座位BMS468.BM1258、BM1815、BM723、SOD1. BMS2258和D14S31,对160头3-5胎次中国荷斯坦奶牛进行多态性检测,采用最小二乘拟合一般线性模型分析微卫星座位与耐热性状部分指标之间的关联效应。结果表明：所选7个微卫星座位在该奶牛群体中均表现出丰富的遗传多态性,多态信息含量、遗传杂合度和有效等位基因数的平均值分别为0.64089、0.6866和3.2789。微卫星座位BMS468与耐热系数、产奶量下降率和红细胞钾含量显著相关的最有利基因型为134bp/128bp(P<0.05),与红细胞膜Na+,K+-ATP酶活显著相关的最有利基因型为140bp/134bp(P<0.05)；微卫星座位BM1258与产奶量下降率显著相关,最有利基因型为101bp/99bp(P<0.05)；微卫星座位BM1815与耐热系数、红细胞钾含量和红细胞膜Na+,K+-ATP酶活显著相关,最有利基因型为186 bp /148 bp(P<0.05)；微卫星座位BM723与产奶量下降率、红细胞膜Na+,K+-ATP酶活和红细胞钾含量显著相关,最有利基因型为161 bp/111 bp(P<0.05)；微卫星座位BMS2258与产奶量下降率和血清GSH-px酶活显著相关,最有利基因型为182 bp/164 bp(P<0.05)；微卫星座位SOD1与耐热系数和产奶量下降率显著相关,最有利基因型为148 bp/148 bp(P<0.05),与血清SOD酶活显著相关的最有利基因型为148 bp/146 bp(P<0.05);微卫星座位D14S31与产奶量下降率显著相关,最有利基因型为176 bp/152 bp(P<0.05).本研究发现了对奶牛耐热性状有显著效应、多态性较高的微卫星基因座,为开展奶牛耐热性的标记辅助选择提供了有价值的遗传标记。4 ATP1A1基因多态性及其与奶牛耐热性状的关联分析为了研究ATP1A1基因多态性及其与奶牛耐热性状的相关性,寻找影响奶牛耐热性状的QTL,为分子标记辅助选择奶牛耐热性新品系提供相应依据。以160头3-5胎次的健康高产中国荷斯坦奶牛为实验材料,采取PCR-LIS-SSCP和DNA测序等方法进行多态位点检测及基因型分析,研究单个多态位点基因型及不同多态位点的合并基因型与奶牛耐热性状的关系。结果表明,与GenBank ATP1A1基因(NC 007301.3)序列比较,ATP1A1基因外显子5、14和17各发现一个沉默SNP突变,分别为-4357bp处A/G、-14103bp处G/A和-15739 bp处C/A；内含子5发现1个SNP,为-4397bp处T/G；内含子14发现3个SNP,分别为-14242bp处C/T、-14829处T/-和-14997处G/A,统计分析表明4个多态位点的不同基因型个体间的耐热系数、产奶量下降率、红细胞钾含量和红细胞膜Na+，K+-ATP酶活性存在显著差异；在P5和P17位点,AA基因型为各自位点上的耐热性状最有利基因型,在P14和P15位点,AC基因型为各自位点上的耐热性状最有利基因型。合并基因型与耐热性状的关联分析表明,最佳合并基因型AAACACAA是4个多态位点上单个最优基因型的组合,但高于最好的单个基因型效应。本研究表明ATP1A1基因4个多态位点附近可能存在影响奶牛耐热性状的QTL,ATP1A1基因可能是影响奶牛耐热性状的重要基因之一