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本研究从中国鲎（Tachypleus tridentatus）血淋巴中提取血蓝蛋白并用AKTA pure蛋白纯化系统对其进行纯化,用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）技术进行蛋白鉴定;采用五种体外化学检测法对中国鲎血蓝蛋白及其酶解肽的抗氧化能力进行测定;选用小鼠黑素瘤B16细胞系,测定血蓝蛋白多肽对B16细胞黑色素合成、细胞形态、酪氨酸酶活性和细胞增殖的影响,为中国鲎血蓝蛋白以及鲎血源活性物质相关研究提供参考。本研究得到的结果如下:1.中国鲎血蓝蛋白提纯及其纯化物的液相质谱联用分析从中国鲎的血淋巴中提取血蓝蛋白并采用AKTA pure蛋白纯化仪对其进行纯化。使用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）技术对其进行定性分析,将得到的质谱原始文件用Maxquant（1.6.2.10）在目标蛋白数据库中进行检索。根据蛋白质得分score值、序列覆盖度的大小及蛋白相对强度进行综合分析。最后从uniprot数据库下载了包括凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）、锯缘青蟹（Scylla serrata）和四种鲎科动物:中国鲎（Tachypleus tridentatus）、圆尾鲎（Carcinoscorpius rotundicauda）、美洲鲎（Limulus polyphemus）、巨鲎（Tachypleus gigas）在内的22条相关的血蓝蛋白序列,用Clustal W方法对22条血蓝蛋白氨基酸序列进行多序列对比,并用MEGA7软件构建N-J系统进化树。结果表明,从纯化后的中国鲎血蓝蛋白中鉴定到12种血蓝蛋白的亚基,包括Hemocyanin subunit I、Hemocyanin subunit II、Hemocyanin subunit IIIa、Hemocyanin subunit IIIb、Hemocyanin subunit IV、Hemocyanin subunit V、Hemocyanin subunit VI等。Uniprot数据库显示,这些亚基最早在圆尾鲎和美洲鲎体内被发现。N-J系统进化树显示四种鲎科动物的血蓝蛋白进化关系更近,其次鲎科动物血蓝蛋白与凡纳滨对虾和锯缘青蟹的血蓝蛋白也有较近的进化关系。2.中国鲎血蓝蛋白及其酶解肽抗氧化活性的比较研究从中国鲎的血淋巴中提取血蓝蛋白,并对其及相关酶解肽（酶解时间分别为30min、1h、3h）进行体外抗氧化活性研究。测定血蓝蛋白及其酶解肽对羟基自由基、超氧自由基、过氧化氢、DPPH的清除能力以及抗脂质过氧化的能力。实验结果表明,中国鲎血蓝蛋白对DPPH、羟基自由基、超氧自由基、过氧化氢均具有清除能力,除对DPPH的清除能力较低以外(IC50值为14mg/m L),对羟基自由基(IC50值为1.63 mg/m L)、超氧自由基(IC50值为0.42mg/m L)、过氧化氢(IC50值为0.89 mg/m L)的清除能力都较强。中国鲎血蓝蛋白的抗脂质过氧化能力也较强,IC50值为0.05 mg/m L。中国鲎血蓝蛋白酶解肽对DPPH(IC50值大于50 mg/m L)、羟基自由基(IC50值为17～30 mg/m L)、超氧自由基(IC50值为6.5～9.0 mg/m L)的清除能力相对较弱,对过氧化氢(IC50值为0.56～0.91 mg/m L)有很强的清除能力且抗脂质过氧化(IC50值为0.047～0.071 mg/m L)的能力也较强。在三组酶解肽中,酶解3h的多肽清除自由基的能力最强。值得一提的是,中国鲎血蓝蛋白在达到预设的最大浓度时对羟基自由基、超氧自由基和过氧化氢的清除能力均接近阳性对照Vc,其中酶解3h的多肽对过氧化氢的清除能力强于阳性对照Vc。实验结果表明,中国鲎血蓝蛋白具有良好的抗氧化活性,但其酶解肽的抗氧化活性较未酶解的血蓝蛋白稍弱。3.中国鲎血蓝蛋白多肽的美白作用研究从中国鲎血淋巴中提取血蓝蛋白并对其酶解肽进行美白作用研究。我们把酶解3h的血蓝蛋白多肽配制成62.5μg/m L、125μg/m L、250μg/m L、500μg/m L、1000μg/m L的溶液,探究不同浓度血蓝蛋白多肽对小鼠B16细胞的黑色素合成、细胞形态、细胞增殖和酪氨酸酶活性的影响。实验结果表明:中国鲎血蓝蛋白多肽在低浓度时对B16细胞的增殖无显著性影响,当浓度达到250μg/m L时对B16细胞的增殖有抑制作用。不同浓度的血蓝蛋白多肽对B16细胞形态均无显著影响。以上两点说明中国鲎血蓝蛋白对B16细胞无毒或具有低毒性。中国鲎血蓝蛋白多肽对B16细胞黑色素合成和酪氨酸酶活性有轻微的抑制作用,在浓度达到1000μg/m L时,中国鲎血蓝蛋白多肽对B16细胞黑色素合成和酪氨酸酶活性的抑制率分别为12%和15%。综上所述,中国鲎血蓝蛋白与其他三种鲎科动物血蓝蛋白的进化关系极近。中国鲎血蓝蛋白具有良好的清除自由基的能力,表现出了良好的抗氧化活性。但中国鲎血蓝蛋白多肽对小鼠B16细胞黑色素合成和酪氨酸酶活性的抑制效果较差,这可能是由于多肽分子量过大阻碍了其进入细胞发挥作用。本课题的研究结果为中国鲎血蓝蛋白的研究奠定了基础,同时也为中国鲎血清的深加工提供了新的思路。