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第一部分 TREM2在肥胖致胰岛素抵抗小鼠模型附睾脂肪组织中的动态表达变化研究目的:髓系细胞触发受体-2(trigger receptor expressed on myeloid cells 2,TREM2)最早发现于巨噬细胞等髓系细胞,调控多种生物学功能。近年来,研究发现TREM2基因也表达于成熟的脂肪细胞。在肥胖动物模型的脂肪组织中,TREM2基因表达水平显著升高。众所周知,脂肪组织重塑在肥胖致胰岛素抵抗发生发展的病理过程中发挥关键作用,而其重塑过程又以对脂肪细胞和巨噬细胞数量和功能的调节最为重要。然而,上述两种细胞的TREM2是否参与了脂肪组织的重塑过程,进而调控了肥胖致胰岛素抵抗的发生发展,尚未见研究报道。本部分研究,旨在通过对6周龄C57BL/6野生型小鼠予以60%脂肪热能高脂饲料,饲养16周,诱导肥胖致胰岛素抵抗小鼠模型,观察附睾脂肪组织中脂肪细胞和巨噬细胞TREM2基因表达水平的动态变化,并初步探讨TREM2基因表达与脂肪组织重塑发生发展之间的关系。研究方法:1.6周龄C57BL/6野生型小鼠随机分为高脂组和对照组,分别予以60%脂肪热能高脂饲料和10%脂肪热能对照饲料,饲养16周。2.分别于饲养第0、4、8、12和16周取两组小鼠的附睾脂肪组织,采用差速离心的方法,分离纯化脂肪细胞;采用贴壁培养的方法,获取附睾脂肪组织中的巨噬细胞。采用实时荧光定量PCR反应测定两组小鼠附睾脂肪组织中脂肪细胞和巨噬细胞TREM2基因的动态表达水平。研究结果:1.高脂组小鼠饲养第4、8、12和16周体重显著增加(p<0.0001),附睾脂肪组织重量显著增加(p<0.0001);饲养第8、12和16周肝脏重量显著增加(p<0.01)。自饲养第12周开始,高脂组小鼠附睾脂肪组织开始出现脂肪细胞肥大、脂肪细胞坏死,巨噬细胞浸润,冠状结构形成等典型的脂肪组织重塑病理学特征;同时小鼠肝脏发生脂肪变性,出现肝细胞脂肪变性、肝细胞水肿、炎性细胞浸润和炎性灶形成等病理学表现,提示异位脂质沉积。进一步研究发现,饲养第12周,高脂组小鼠空腹血糖水平显著升高(4.92±0.32mmol/L vs.14.17±1.54mmol/L,p<0.01),对胰岛素敏感性显著下降(p<0.0001)。2.饲养第12、16周,高脂组小鼠附睾脂肪组织中脂肪细胞TREM2基因表达水平显著升高(p<0.01);饲养第12周,高脂组小鼠巨噬细胞TREM2基因表达水平显著高于对照组(p<0.0001)。研究结论:1.本研究采用高脂饲养成功构建肥胖致胰岛素抵抗小鼠模型,饲养第12周,小鼠附睾脂肪组织开始出现典型的脂肪组织重塑病理学特征。2.饲养第12周,高脂组小鼠附睾脂肪组织中脂肪细胞和巨噬细胞TREM2基因表达水平显著升高。第二部分 TREM2在肥胖致胰岛素抵抗小鼠模型中的作用和机制研究研究目的:第一部分研究发现,高脂饲养诱导的肥胖致胰岛素抵抗小鼠模型附睾脂肪组织中脂肪细胞和巨噬细胞TREM2基因表达水平升高,于饲养第12周达到最大值,同时小鼠附睾脂肪组织开始表现出典型的脂肪组织重塑病理学特征。上述结果提示,在肥胖致胰岛素抵抗的发生发展中,脂肪细胞和巨噬细胞的TREM2可能通过调控脂肪组织重塑发挥重要作用。因此,本部分研究在TREM2全身敲除小鼠(TREM2-/-小鼠)中,采用高脂饲养构建肥胖致胰岛素抵抗模型,证实该假设,从而阐明TREM2在肥胖致胰岛素抵抗病理过程中的作用和可能机制。研究方法:1.将6周龄C57BL/6野生型和TREM2-/-小鼠配对后随机分为高脂组和对照组,分别予以60%脂肪热能高脂饲料和10%脂肪热能对照饲料,饲养12周,构建肥胖致胰岛素抵抗小鼠模型。饲养期间,观察小鼠的体重变化和摄食量高低。2.饲养12周后,称量小鼠附睾脂肪组织及肝脏的重量,并计算其所占体重的比例;对脂肪组织和肝脏进行HE染色,评估其病理学改变。测定小鼠空腹血糖、游离脂肪酸、甘油三酯和胆固醇,评估其糖脂代谢水平。对小鼠进行葡萄糖耐受试验和胰岛素耐受试验,并采用Western blot检测附睾脂肪组织胰岛素信号通路的活化水平,评估其胰岛素抵抗程度。3.采用ImageJ图像分析软件测量高脂组小鼠附睾脂肪组织中脂肪细胞的截面积大小,并统计不同大小脂肪细胞在附睾脂肪组织中的分布情况。对附睾脂肪组织进行脂滴包被蛋白(Perilipin)染色,评估脂肪细胞坏死的情况。对附睾脂肪组织进行F4/80染色,并结合流式细胞分析,评估脂肪组织中巨噬细胞的数量和表型的变化。采用实时荧光定量PCR反应检测小鼠附睾脂肪组织、其脂肪细胞MCP-1的表达水平,通过Western blot检测小鼠脂肪细胞MCP-1的蛋白水平,并通过ELISA检测小鼠循环中MCP-1水平。采用实时荧光定量PCR反应测定两组小鼠附睾脂肪组织及其巨噬细胞TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS的表达水平。研究结果:1.对照饲料饲养下,与野生型小鼠相比,TREM2-/-小鼠体重、附睾脂肪组织和肝脏病理学特征以及胰岛素敏感性无显著差异。高脂饲料饲养下,与野生型小鼠相比,TREM2-/-小鼠体重显著增加(p<0.01),肝脏脂肪变性程度显著加重,空腹血糖水平显著升高(14.33±0.90mmol/L vs.17.49±1.19mmol/L,p<0.05),胰岛素敏感性显著下降(p<0.01)。2.高脂饲养12周后,TREM2-/-小鼠附睾脂肪组织重量显著减轻(2.38±0.09g vs.1.99±0.09g,p<0.01),所占体重比例显著降低(5.23±0.23%vs.4.15±0.20%,p<0.01)。TREM2-/-小鼠附睾脂肪组织中脂肪细胞截面积显著增大(2.1±0.1 ×104μm2 vs 5.0±0.2×104μm2，p<0.0001);且小体积脂肪细胞所占比例降低,大体积脂肪细胞所占比例升高。TREM2-/-小鼠附睾脂肪组织中脂肪细胞坏死比例显著增加(p<0.001),且坏死脂肪细胞周围无巨噬细胞浸润,冠状结构基本消失。3.高脂饲养12周后,TREM2-/-小鼠附睾脂肪组织中脂肪细胞MCP-1基因的表达水平显著降低(p<0.01),蛋白水平显著降低;脂肪组织整体MCP-1基因的表达水平显著降低(p<0.01);TREM2-/-小鼠循环中MCP-1水平显著降低(176.8±13.9pg/ml vs.126.1±7.0pg/ml,p<0.01)。4.高脂饲养12周后,TREM2-/-小鼠附睾脂肪组织中巨噬细胞所占比例显著降低(56.7±2.8%vs.48.1±1.7%,p<0.05);数量显著减少(每克脂肪组织含巨噬细胞6.57±0.42×105 2.85±0.58×105,p<0.001)。TREM2-/-小鼠附睾脂肪组织中F4/80+CD11c+巨噬细胞(即募集的巨噬细胞)比例显著降低(36.5±3.1%vs.7.8±0.6%,p<0.001);F4/80+CD206+巨噬细胞(即原驻的巨噬细胞)比例显著升高(36.7±2.6%vs.43.1±1.3%,p<0.05)。5.高脂饲养12周后,与野生型小鼠相比,TREM2-/-小鼠附睾脂肪组织及其巨噬细胞IL-1β、IL-6和iNOS的表达水平显著升高(p<0.05)。研究结论:1.TREM2调控了高脂饲养下小鼠附睾脂肪组织的重塑过程。2.可能机制如下:1)TREM2促进脂肪细胞增殖,抑制脂肪细胞肥大和脂肪细胞坏死;2)TREM2诱导脂肪细胞合成MCP-1,募集F4/80+CD11c+巨噬细胞浸润,对坏死的脂肪细胞进行包裹隔离和有效清理;3)TREM2减少巨噬细胞炎性介质释放。通过上述途径,TREM2调控脂肪组织重塑,降低了脂肪组织整体的炎症反应。3.TREM2在肥胖致胰岛素抵抗小鼠模型中发挥了一定的保护作用。