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单克隆抗体有着特异性强、重复性好的特点,可开发成诊断试剂盒和试纸条及应用于各项基础研究。本研究旨在研制出O型口蹄疫病毒(FMDV)的单克隆抗体,进而为研制快速、特异、灵敏和便捷的检测FMDV抗原试剂盒和试纸条打下基础。 通过细胞培养和病毒增殖的方法获得含O型FMDV的培养液,经过病毒灭活,浓缩,离心等步骤,提纯得到了O型FMDV全病毒抗原。用该抗原对BALB/C小鼠进行常规免疫,经四次免疫后,应用PEG-1000,将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞,进行细胞融合,制备杂交瘤细胞株,经间接ELISA筛选和多次克隆化,获得3个能分泌FMDV抗体的单克隆杂交瘤细胞株,分别命名为细胞株2F1、6H4和2G7。 经单克隆抗体亚类鉴定,细胞株6H4和2G7分泌的抗体为IgG1亚类,2F1分泌的抗体为IgG2b亚类。特异性检测结果显示,3株单克隆抗体杂交瘤细胞株不与BHK-21正常细胞培养上清液发生反应,与A型、C型和Asial型FMDV抗原不发生型间交叉反应。经间接ELISA测定,细胞培养上清液效价2F1为1:800,6H4为1:6400,2G7为1:800;腹水效价2F1为1:1×10~4,6H4为1:4×10~5,2G7为1:1×10~4。 单克隆抗体稳定性检测发现,细胞株6H4多次传代后腹水效价能保持在1:8×10~5以上,而2F1和2G7在多次传代后腹水效价也都能保持在1:1×10~4左右。纯化后6H4单克隆抗体的SDS-PAGE结果显示,Ig抗体重链和轻链,分子量分别在45.0kD和25.0kD左右。对细胞株6H4的染色体计数结果发现,该细胞株有100条染色体。 通过ELISA试验对3株单克隆抗体的抗原识别位点进行了分析,结果显示,杂交瘤细胞株6H4与2F1针对的抗原表位是部分重叠的,而与2G7针对的抗原表位是完全不一致的。 单克隆抗体结合胶体金技术初步应用研究表明,采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,可以对6H4单克隆抗体进行标记。6H4单克隆抗体在pH 8.64下的稳定点为12mg/L,可制备成金标记抗体,并制成金标记抗体反应膜,有望参与组装成检测FMDV抗原的测试条。 本研究研制出了O型FMDV的单克隆抗体,并为尽快研制出检测FMDV抗原的测试条产品打下了坚实的基础。