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目的本研究首先采用糖尿病心肌病变(Diabetic Cardiomyopathy, DCM)大鼠模型,研究内分泌血管活性肽优洛可啶(Urocortin)对DCM大鼠血清生化指标、血流动力学、心肌细胞内钙离子水平及心肌重构的影响,探讨Urocortin对DCM大鼠心肌肥厚和纤维化的保护作用及其可能机制。另外,研究了Urocortin对高糖(High glucose, HG)诱导的乳大鼠心肌细胞肥大作用的影响,探讨Urocortin对心肌细胞内荧光钙离子含量([Ca2+]，)瞬间变化及钙调神经磷酸酶(Calcineurin,CaN)表达的影响,从而阐明Urocortin对HG诱导心肌细胞肥大的保护作用。研究Urocortin可抑制HG诱导心肌细胞肥大的作用呈剂量依赖性,其保护作用可能与抑制心肌细胞内钙含量及抑制CaN表达有关。本研究将为临床防治DCM提供新的依据及理论基础,为治疗DCM提供新的药物作用靶点。方法1.在体实验部分：1.1本部分实验采用100只健康的雄性Wistar大鼠,随机选取80只大鼠尾静脉注射给予链脲佐菌素(Strcptozotocin, STZ),55mg·kg-1,连续给药3d,应用AccuCheck血糖仪监测大鼠尾静脉血糖,空腹血糖≥16.7 mmol·L-1视为DM大鼠造模成功。其余20只Wistar大鼠作为正常对照组(Control组)。上述DM大鼠造模成功后,饲养12周,造成DCM模型大鼠,剔除中间死亡鼠,将DCM大鼠随机分为4组,每组10只,包括：糖尿病心肌病变组(DCM组)、Urocortin药物组(Urocortin 7μg·kg-1, UCN组)、Urocortin (7μg·kg-1)+Astressin (35 u g·kg-1)组(UCN+AST组)和Urocortin (7μg·kg-1)+Triciribine (0.5mg·kg-1)组(UCN+TRI组),每组实验动物日一次腹腔注射相应受试药物4周,DCM组日一次腹腔注射相等体积的生理盐水。给药期间及给药结束后观察各组实验动物一般状态的改变。1.2上述各组受试实验动物,给予相应药物4周后,采用2096乌拉坦(1g·kg-1)麻醉上述各组实验动物,应用BL-420F生物机能实验系统分别测定各实验组大鼠心脏功能状态；颈动脉取血2ml,测定下列指标。包括：测定各实验组动物血清中C-肽、糖化血红蛋白(Glycosylated hemoglobin,HbAlc)、肌酸激酶同工酶MB (Creatine kinase isoenzyme-MB, CK-MB)、脑钠肽(B-type natriuretic peptide,BNP)。采用ELISA方法测定血清中转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1, TGF-β1)、结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor, CTGF)水平。1.3血流动力学测定结束后,各实验组选取一半实验动物,电子天平称大鼠心脏质量、左心室质量,计算大鼠心脏质量指数(Heart weight index, HWI)和左心室质量指数(Left ventricular mass index, LVMI); HE染色观察心脏的形态学变化并测定心肌胶原容积分数(Myocardial collagen volume fraction, CVF)。1.4上述实验完毕后,各实验组选取剩余一半实验动物,急性分离各实验组心肌细胞,测定心肌细胞内钙离子水平；应用RT-PCR方法测定各实验组心肌细胞TGF-β1和CTGF mRNA的表达水平,采用Western blot的方法测定各实验组心肌细胞TGF-β1、CTGF、蛋白激酶B(Akt)、糖原合成酶激酶3β(Glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)、磷酸化蛋白激酶B (p-Akt)、磷酸化糖原合成酶激酶3β(p-GSK-3β)的水平。2.离体实验部分：2.1本部分实验采用新出生2-3 d的Sprague-Dawley (SD)大鼠的乳鼠,体外原代培养乳大鼠心室肌细胞,应用高糖(HG,25mmol·L-1)诱导心室肌细胞肥大,观察不同浓度Urocortin对HG诱导的心肌细胞肥大的影响。将培养的乳大鼠心肌细胞随机分成5组,包括：正常对照组(Normal组)、HG诱导的模型组(HG组)、Urocortin低剂量组(1μmol· L-1, UCN-L组),Urocortin中剂量组(5μmol·L-1,UCN-M组),Urocortin高剂量组(10μmol·L-1,UCN-H组)。2.2给予上述不同处理因素孵育48 h,用Lowry法检测心肌细胞内蛋白含量；消化分离法以及细胞图像分析系统测量单个细胞的直径,用球的体积公式计算细胞的体积；采用MTT检测法测定各组心肌细胞的存活率；应用Till阳离子测定系统,并以Fura-2/AM为荧光探针,测定各组心肌细胞内[Ca2+]i的瞬间变化；应用Western Blot方法测定CaN表达,CAMIAS008图像分析系统进行半定量分析,即以CaN/β-actin的IA比值表示CaN蛋白的相对表达水平。结果1.在体实验结果：1.1与Control组相比,各实验组DCM大鼠出现明显的三多一少症状,活动减少、易感染。与DCM对照组相比,Urocortin受试组实验动物状态有所改善,体重增加,尿量减少,尿糖降低(P<0.05)。1.2与Control组相比,各实验组DCM大鼠左心室收缩压(Left ventricular systolic pressure,LVSP)和左心室舒张期末压(Left ventricular diastolic fi nal pressure,LVEDP)均明显升高,左心室内压最大上升和下降速率(±dp/dtmax)均显降低,具有显著性差异(P<0.05)；各实验组大鼠血清C-肽水平明显下降,HbAlc、CK-MB、BNP、TGf-β1、CTGF 水平均明显增高,与Control组相比有显著性差异(P<0.05)；各实验组大鼠HW1、LVMI和急性分离的心肌细胞内钙离子水平均升高,与Control组相比具有显著性差异(/K0.05)。与DCM对照组相l比,Uroc()rtin受试组大鼠LVSP和LVEDP均降低,±dp/dtmax均升高,血清HbAlc、CK-MB、BNP、TGF-β1、CTGT水平均降低；HW1、LVM1和心肌细胞内钙离子水平均降低,与DM组相比具有显著性差异(P<0.05)。另外,Astressin和Triciribine分别能阻断Urocortin的上述作用,与Urocortin受试组相比具有显著性差异(P<0.05)。1.3病理切片结果显示,Control组大鼠心肌细胞形态正常,肌纤维排列规则；DCM大鼠心肌细胞肥大变性,细胞间隙增宽,胶原纤维明显增多,CVF明显增高,与Control组相比具有显著性差异(P<0.05)。Urocortin能改善上述病理变化,CVF明显降低,与DCM组相比具有显著性差异(P(0.05)。然而,经Astressin和Triciribine干预后,心肌细胞明显损伤,肌纤维增粗,胶原增多,CVF增高,与Urocortin受试组相比具有显著性差异(P<0.05)。1.4与Control组相比,各DCM实验组急性分离的大鼠心肌细胞内的钙离子水平明显升高,具有显著性差异(P<0.05)。Urocortin受试大鼠急性分离的心肌细胞内钙离子水平明显降低,与DCM组相比具有显著性差异(P<0.05)。然而,Astressin和Triciribine分别能阻断Urocortin对DCM心肌细胞内钙离子的影响,与Urocortin受试组相比具有显著性差异(P<O.05)。1.5与Control组相比,各实验组DCM大鼠心肌细胞TGF-β1、CTGF表达明显增高(P<0.01)。与DCM组相比,UCN组心肌细胞TGF-β1、CTGF表达降低(P<0.01)。另外,给予CRH-R2阻断剂,Astressin能阻断Urocortin的上述作用(P<0.01),Triciribine能部分阻断Urocortin的作用(P<0.01)。与Control组相比,各实验组DCM大鼠心肌细胞p-Akt、p-GSK-3β明显降低(P<0.01)。与DCM组相比,UCN组心肌细胞p-Akt、p-GSK-3β明显增高(P<0.01)。然而Astressin能阻断Urocortin的作用(P<O.01)。2.离体实验结果：2.1 HG诱导的心肌细胞出现形态改变,皱缩,细胞拉长增大,数量显著减少,在形态上趋向于成纤维细胞。给予不同浓度Urocortin,细胞形态和生长状态趋于正常。2.2与Normal组相比,HG(25mmol·L-1)组心肌细胞蛋白质含量增加46.2%,体积增大81.3%,心肌细胞存活率降低36.1%,具有显著性差异(P<0.01)。Urocortin不同浓度给药组使HG诱导的心肌细胞总蛋白含量降低,细胞体积减小,心肌细胞存活率升高,与HG组相比具有显著性差异(P<0.05)。其中,UCN-L组,心肌细胞的总蛋白含量、细胞体积分别降低6.8%,10.6%,心肌细胞存活率增加11.8%。与HG组相比,UCN-M及UCN-H组能显著降低心肌细胞总蛋白含量、细胞体积,并能明显升高心室肌细胞存活率(P<O.01)。不同浓度Urocortin实验组,对上述实验结果的影响呈剂量依赖性(r＝0.94)。2.3与Normal组相比,HG组心肌细胞内荧光[Ca2+]i瞬变增加62.5%,CaN表达显著增加,具有显著性差异(P<0.01)。不同浓度Urocortin受试实验组中心肌细胞内荧光[Ca2+]i瞬间变化降低,CaN表达也减少,与HG组相比具有显著性差异(P(0.05)。其中,Urocortin低、中、高浓度组对心肌细胞[Ca2+].瞬间变化和CaN蛋白表达的影响上呈剂量依赖性(r=0.95)。结论1. Urocortin能改善DCM大鼠的一般状态,改善DCM大鼠的心脏功能和血流动力学指标,降低HbAlc、CK-MB、BNP水平,对DCM具有治疗作用。2. Urocortin能减轻DCM大鼠心肌的病理改变,抑制心肌肥厚与纤维化,逆转DCM大鼠心肌细胞的钙超载,对DCM大鼠心肌组织具有保护作用。3. Urocortin对DCM的影响可能是与CRH-R2受体结合后激活Akt/GSK-3β信号通路,进而下调TGF-β1及CTGF的表达有关。4. Urocortin对HG诱导的心肌细胞具有保护作用,能降低HG的心肌细胞蛋白质含量,缩小细胞体积,提高细胞存活率。5. Urocortin对HG诱导的心肌细胞肥大的保护作用可能与逆转钙超载和减少CaN表达有关。