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目的:支气管哮喘(简称哮喘)是当今世界最常见的慢性疾病之一,目前国、内外的研究认为,哮喘的本质是气道慢性炎症,并在此基础上出现气道高反应性和气道重构。而气道平滑肌的增殖在哮喘气道重构中起着重要作用,是不可逆性气流阻塞、持续气道高反应性的重要病理基础。但是,哮喘气道平滑肌增殖的调控机制目前尚不十分清楚。吸烟是影响哮喘发生、发展的重要危险因素,它可以增加哮喘发生频率和症状严重程度。目前研究发现,吸烟可以降低皮质激素对哮喘患者的治疗效果。香烟烟雾中含有6000多种化学物质,其中多种物质有毒。香烟烟雾能增加卵白蛋白致敏豚鼠气道急性变应性炎症。我们以往的研究发现,香烟提取物(CSE)可以促进哮喘大鼠气道平滑细胞(ASMCs)的增殖,但其具体机制尚未阐明。国内外研究表明,细胞分裂及细胞数量的增加要通过细胞周期,在细胞周期中必须有细胞周期蛋白的参与,这种蛋白对细胞周期起调控作用。而D1类细胞周期蛋白(cyclinD1)是调节细胞周期G1期向S期转变的关键因子,参与众多细胞周期的调控。CSE是否通过cyclinD1参与调控ASMCs增殖,目前相关研究报道尚少见。本实验通过建立哮喘大鼠模型,体外培养ASMCs,在细胞水平研究CSE对ASMCs的增殖作用、对cyclinD1表达的影响以及PKC-cyclinD1信号通路是否参与CSE促ASMCs的增殖过程,探讨CSE促进ASMCs增殖的可能机制。为进一步深入了解哮喘的发病机制,寻找有效的治疗方法提供理论依据。方法:1建立大鼠哮喘模型,原代培养大鼠ASMCs。用CSE和细胞周期蛋白依赖激酶-4抑制剂GW8510干预哮喘大鼠ASMCs,用四甲基偶氮唑盐(MTT)法、流式细胞术及增殖细胞核抗原(PCNA)免疫细胞化学技术检测ASMCs增殖;用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(Western blot)检测细胞周期蛋白D1(cyclinD1)的表达。研究CSE对ASMCs的增殖作用以及对cyclinD1表达的影响。2建立大鼠哮喘模型,原代培养大鼠ASMCs。用CSE和cyclinD1反义表达质粒干预哮喘大鼠ASMCs,用四甲基偶氮唑盐(MTT)法、流式细胞术及增殖细胞核抗原(PCNA)免疫细胞化学技术检测ASMCs增殖;用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(Western blot)检测细胞周期蛋白D1(cyclinD1)的表达。研究CSE和cyclinD1反义表达质粒对ASMCs增殖的干预作用。3建立大鼠哮喘模型,原代培养大鼠ASMCs。用CSE和PKC激动剂PMA以及抑制剂Ro-31-8220干预哮喘大鼠ASMCs,用四甲基偶氮唑盐(MTT)法、流式细胞术及增殖细胞核抗原(PCNA)免疫细胞化学技术检测ASMCs增殖;用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(Western blot)检测cyclinD1和PKC-α的表达。探讨PKC-cyclinD1信号通路是否参与CSE促ASMCs的增殖。结果:1.与对照组ASMCs相比,CSE处理组G0/G1期细胞所占比例明显减少,S+G2M期细胞所占比例明显增高,吸光度A值、PCNA阳性表达率明显增高。cyclinD1 mRNA和蛋白的表达明显增加。哮喘组与对照组相比,G0/G1期细胞所占比例明显减少,S+G2M期细胞所占比例明显增高,吸光度A值、PCNA阳性表达率明显增高。cyclinD1mRNA和蛋白的表达明显增加。经GW8510干预后,哮喘组ASMCs G0/G1期细胞所占比例明显增高,S+G2M期细胞所占比例明显降低,吸光度A值、PCNA阳性表达率明显降低。cyclinD1 mRNA和蛋白的表达明显减少。2.反义质粒组与对照组相比,G0/G1期细胞所占比例明显增高,S+G2M期细胞所占比例明显降低,吸光度A值、PCNA阳性表达率明显降低。cyclinD1 mRNA和蛋白的表达明显减少。CSE组与CSE+反义质粒组相比其G0/G1期细胞所占比例明显减少,S+G2M期细胞所占比例明显增高,吸光度A值、PCNA阳性表达率明显增高。cyclinD1mRNA和蛋白的表达明显增加。3.与CSE组相比,Ro-31-8220处理组G0/G1期细胞所占比例明显增高,S+G2M期细胞所占比例明显降低,吸光度A值、PCNA阳性表达率明显降低。cyclinD1,PKC-αmRNA和蛋白的表达明显减少。CSE+PMA组和CSE+PMA+反义质粒组相比其G0/G1期G0/G1期细胞所占比例明显减少,S+G2M期细胞所占比例明显增高,吸光度A值、PCNA阳性表达率明显增高。cyclinD1,PKC-αmRNA和蛋白的表达明显增加。结论:1.哮喘大鼠ASMCs增殖活性明显增强,CSE可以促进哮喘大鼠ASMCs增殖,cyclinD及其亚型cyclinD1在哮喘大鼠ASMCs的增殖中发挥了重要的作用。2.cyclinD1反义表达质粒可以抑制哮喘大鼠ASMCs的增殖,即使再用CSE刺激,也不能明显改善ASMCs增殖能力,CSE可能是通过作用于cyclinD1来影响ASMCs的增殖。3.PKC信号通路可能参与了CSE促进哮喘大鼠ASMCs的增殖作用,PKC可能是通过cyclinD1调控哮喘大鼠ASMCs增殖。CSE促进哮喘大鼠ASMCs增殖可能是通过PKC-cyclinD1级联反应引起的。