第一部分近红外荧光染料用于肿瘤细胞成像的特性研究研究背景:癌症因病理复杂以及发病初期确诊性差,成为病人死亡的主要原因。已有的研究证实早期诊断可以为癌症治疗提供很好的治疗策略。癌细胞的一个的主要生物学特征是瓦伯格效应---有氧糖酵解增加。研究表明快速增殖的癌细胞有氧糖酵解的速率是正常细胞的200多倍。导致癌细胞的葡萄糖消耗量相比于正常的组织细胞显著增加。多年来,研究人员通过不断的努力将荧光染料和葡萄糖类似物偶联起来,合成多种可供细胞摄取的荧光染料葡萄糖类似物,根据癌细胞和正常组织细胞摄取的差异性,可以很好的区分出肿瘤细胞。但是传统的荧光染料标记的葡萄糖类似物因敏感性低、穿透性弱、容易淬灭等弱点限制了应用。新型近红外荧光染料在结构上经过改进之后具有组织穿透性强、生物样品图像损伤小以及信噪比高的优点。此染料偶联上葡糖糖类似物后可以通过细胞膜上的葡萄糖转运蛋白-1(GLUT-1)被细胞摄取,因此,开发出新的荧光标记的葡萄糖类似物,开展肿瘤细胞成像和生物特性的研究,鉴别肿瘤细胞,应用于癌症的诊断;也可监测细胞的葡萄糖消耗;还可用于葡萄糖摄取调节剂的研究。目的:研究新型近红外荧光染料N2在肿瘤细胞和正常细胞上的摄取差异性,并研究其摄取进入细胞的特性和可能的机制,为实际应用提供详细的参数。方法:1.分别培养收集HL-7702、HepG2、GES-1、NCI-N87四株细胞,用Western Blot方法检测GLUT-1蛋白。2.配制不同浓度的N2荧光染料加入到上述细胞培液中,6 h、24 h后用CCK-8法分别检测细胞存活率。3.分别用6μM、24μM的荧光染料N2孵育四株细胞,3 h后进行荧光拍照。4.分别用6μM、24μM的荧光染料N2孵育四株细胞,3 h后,胰酶消化收集细胞进行流式检测。5.将HL-7702、Hep G2细胞用荧光染料N2孵育不同的时间,胰酶消化后收集细胞,进行流式检测。6.将Hep G2细胞预先用200μM的根皮素孵育1 h后,再加入12μM的N2染料孵3 h。或者200 m M的葡萄糖与12μM的N2染料同时加入共孵育3 h。之后用冰PBS洗3次后,进行荧光拍照。定量检测细胞培养与上述方法相同,用胰酶消化收集细胞,进行流式检测。结果:1.葡萄糖转运体蛋白-1(GLUT-1)在肝癌细胞Hep G2、胃癌细胞NCI-N87中高表达,在正常的肝细胞HL-7702、胃细胞GES-1中几乎不表达。2.N2染料对细胞的生长几乎没有影响。3.荧光照片显示Hep G2、NCI-N87两株细胞的荧光强度大于HL-702、GES-1两株细胞。4.流式检测结果显示,Hep G2、NCI-N87两株细胞的荧光强度大于HL-702、GES-1两株细胞。5.N2荧光染料在HL-7702细胞上的摄取量随时间的变化不大,一直处于低水平。但是在Hep G2细胞上的摄取量随着时间延长到120 min后达到一个较高的稳定值。6.D-型葡萄糖可以竞争性的抑制N2染料的摄取,根皮素能够显著的降低细胞对N2荧光染料的摄取。结论:本实验研究证实荧光染料N2是通过GLUT-1蛋白介导进入细胞,并且阐明其在癌细胞和正常细胞中的动力学特性。作为一种新型的近红外荧光染料,N2与传统的近红外荧光染料相比较具有组织穿透性强、敏感性高、低毒性、水溶性好、抗淬灭性好、信噪比低等优点,可应用于肿瘤细胞成像和生物特性的研究,鉴别肿瘤细胞,应用于癌症的诊断;也可监测细胞的葡萄糖消耗;还可用于葡萄糖摄取调节剂的研究,探索肥胖和糖尿病治疗的新方法。第二部分脾虚证小鼠肿瘤恶病质模型的建立研究背景:肿瘤恶病质是一种严重的消耗综合征,主要病理特征为骨骼肌大量降解(伴有或不伴有脂肪组织的分解),引起体重无意识的降低。恶病质是某些癌症患者在肿瘤病程后期的并发症,具有很高的发病率,大约20%的病人因此死亡。目前依然缺乏有效和针对性的肿瘤恶病质治疗药物。中医的临床实践发现中药治疗对肿瘤恶病质具有较好的治疗效果,肿瘤恶病质在中医学中没有对应的病名,中医根据临床表现将之归属于“虚劳”范畴。认为其发病的机理是五脏阴阳气血虚损。正虚为癌瘤发病之根本,毒淤并存是癌瘤发生的致病因素。虚劳多由积渐成,大抵病久体羸叫“虚”,久虚不复叫“损”,损极不复谓“劳”,因邪毒邸张、正气亏损所致。此时,功之不得,补之不受。这一理论与肿瘤恶病质的发生过程相吻合。肿瘤恶病质患者的临床症候确实常表现为虚证,提示我们很可能虚性体质患者在肿瘤的疾病压力下诱发虚劳即恶病质。我国的中药已经被现代药理学证明具有新药开发的价值;而且中医对患者的症候分型也在多年的临床实践中被证实是行之有效的疾病诊疗手段。但是现阶段临床运用中药治疗肿瘤恶病质时,还停留在有临床中医根据其经验尝试性的试用阶段,没有科学、合理的动物实验结果的支持,难以开发出创新性的恶病质治疗新药。已有的恶病质模型都是单纯的疾病诱发的恶病质,不能很好的模拟出临床患者体质虚弱的症状。本课题将疾病模型亦即肿瘤恶病质动物模型与中医相关的症候模型相结合,建立一种病症结合动物模型,以期建立一种更接近临床疾病的动物模型,阐明恶病质的发病机理,筛选新的治疗恶病质的药物。目的:采用三因素法(苦寒泻下、劳倦伤脾、饮食失节)诱导小鼠虚证模型,随后接种鼠源结肠癌C26细胞引发肿瘤恶病质,建立一种标准化的虚证合并肿瘤的恶病质模型。以寻找模拟临床疾病最合适的虚证合并肿瘤恶病质的动物模型。方法:虚证的诱导采用三因素法(苦寒泻下、劳倦伤脾、饮食失节),每日上午8时灌胃番泻叶煎剂0.5 m L(生药含量1 g/m L),第17天起增加至0.7 m L。下午1点对老鼠进行游泳力竭,力竭标准为老鼠表现慌张、四肢动作不协调甚至出现下沉现象,每日力竭2次,间隔10 min。半天禁食,半天自由进食饮水。虚证肿瘤恶病质造模:C26结肠癌移植瘤的肿瘤恶病质模型建立方法是将0.1 m L(1?106个细胞)的C26细胞悬浮液接种于小鼠右前腋皮下,整个接种过程在1个小时内完成。结果:1.虚证模型的建立研究发现三因素诱导小鼠虚证法可以导致动物出现眯眼的精神萎靡现象、大便溏泄、懒动等虚证的症状;虚证组小鼠表现出体重体温降低;胃泌素含量降低;脾脏重和脾脏指数降低;胸腺重和胸腺指数降低等症状,虚证模型诱导成功。2.虚证恶病质模型的建立研究发现整个实验周期内,空白对照组的体重和体温均明显高于虚证组和虚证恶病质组,在恶病质后期,虚证肿瘤恶病质的去瘤体重和体温显著低于肿瘤恶病质组。研究发现,虚证肿瘤恶病质组腓肠肌重明显低于空白组和肿瘤恶病质组,统计分析具有显著差异性。在比目鱼肌、胫骨前肌和附睾脂肪方面,虚证肿瘤恶病质组明显低于肿瘤恶病质组,统计学具有差异性。对于脾脏,虚证肿瘤恶病质小鼠的脾脏重和脾脏指数与虚证组类似,显著低于肿瘤恶病质组。对于胸腺,虚证恶病质组胸腺重及胸腺指数均显著低于虚证组和肿瘤恶病质组。以上实验结果说明,虚证肿瘤恶病质模型可以模拟出虚证和肿瘤恶病质的病症结合特征。结论:以上实验结果说明,本研究所建立的虚证肿瘤恶病质模型可以模拟出临床中虚证体质肿瘤恶病质的机体严重消耗综合病症特征。尤其在腓肠肌、比目鱼肌、胫骨前肌萎缩和附睾脂肪分解方面表现出了较单纯肿瘤恶病质更加严重的耗损,与临床恶病质症状结合更加紧密。该模型的建立提供了一种更加接近临床疾病的动物模型,为肿瘤恶病质的研究及相应的药物筛选和作用机制的研究提供了药理动物模型。