目的:在世界范围内,恶性肿瘤是目前导致死亡的首要原因。其中,肺癌的发病率和病死率均排在首位,对人类的健康和寿命造成了极大的威胁。在肺癌病例中,80%-85%的病例为非小细胞肺癌。即使诊断治疗等手段取得了长足的进步,非小细胞肺癌的五年生存率依然很低。目前认为吸烟是导致肺癌发生影响最大的环境危险因素,但是在吸烟率低于欧洲某些国家的中国女性群体中,肺癌发生率却高于欧洲女性,这说明除吸烟外,还有其他因素在肺癌发生发展过程中发挥着重要作用,比如遗传因素。肺癌作为一种复杂病因疾病,其发病机制及发展过程依然需要更加深入的探索和研究。microRNA是一类长度约为20-24个核苷酸长、内源性、非编码单链RNA,可以通过碱基互补配对原则靶向结合到靶基因mRNA的3’-UTR区,从而发挥抑制靶基因的翻译或降低其mRNA的稳定性的作用,最终调控靶基因蛋白表达、影响细胞或机体的功能。在肿瘤的发生发展过程中,通常存在microRNA表达水平发生变化的现象,致使其下游的靶基因和涉及的信号通路的状态发生改变,从而在肿瘤发生发展过程中发挥作用。通过比较肿瘤组织和癌旁正常组织中microRNA的表达水平,可以筛选出有可能具有重要调控功能的microRNA。因此,本研究通过比较非小细胞肺癌肿瘤组织和癌旁正常组织中microRNA的表达谱,筛选出在非小细胞肺癌中可能具有重要调控功能的microRNA,探索其对非小细胞肺癌细胞生物学行为可能造成的影响,并对该microRNA上下游调控关系进行了深入研究。研究方法:本研究通过对GEO数据库中miRNA(micorRNA)表达谱数据进行计算分析,筛选出具有统计学意义的差异表达的miRNA,并利用功能学研究相关实验方法探索差异表达miRNA在非小细胞肺癌中的功能,并探索和研究其上下游调控路径,进而达到更加了解差异表达miRNA在非小细胞肺癌中作用机制的目的。第一部分研究检索了GEO数据库中非小细胞肺癌miRNA的表达谱数据并得到GSE56036数据集,利用R语言中的R包对数据进行计算和处理,本研究定义差异倍数≥2或者差异倍数≤0.5的miRNA为差异表达miRNA,并绘制miRNA表达谱火山图。同时利用TCGA数据和临床组织样本中miRNA表达数据,验证所选miRNA在非小细胞肺癌中的表达情况。同时利用临床样本信息以及TCGA来源数据,分析了所选miRNA表达量与患者临床特征之间的相关性,以及患者预后相关因素。第二部分研究对筛选出的差异表达的hsa-miR-30a-5p在非小细胞肺癌中的功能进行深入研究。向非小细胞肺癌细胞系感染慢病毒LV-hsa-mir-30a和LV-hsa-miR-30a-5p-inhibition,改变细胞系中原有的hsa-miR-30a-5p的表达量,利用CCK-8实验检测细胞增殖的改变情况;利用7-AAD和Annexin V-APC染料将细胞染上荧光染料,应用流式细胞仪检测细胞凋亡情况;利用transwell小室和结晶紫染料将迁移细胞染色,检测细胞迁移能力,从而判断hsa-miR-30a-5p表达量改变对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡、迁移等生物学行为的影响。第三部分研究对hsa-miR-30a-5p上下游的调控路径进行探索和研究。利用PROMO和Jaspar数据预测hsa-miR-30a-5p上游的转录因子,并利用PCR和ChIP实验验证其对hsa-miR-30a-5p转录和表达的调控作用。利用TargetScan、starBase等数据库预测hsa-miR-30a-5p的下游靶基因,并利用双荧光素酶报告基因实验和Western Blot等实验验证hsa-miR-30a-5p对下游靶基因的调控作用。本研究所用统计假设检验均采用双侧检验,以P<0.05作为差异具有统计学意义的标准。所有统计分析均采用SPSS统计软件进行。两组连续型变量应用t检验进行分析,多组连续型变量应用方差分析进行比较,分类变量间的比较应用卡方检验进行比较,有序分类变量间的比较应用秩和检验,两连续型变量间相关性应用Pearson相关进行分析,单因素生存分析采用Kaplan-Meier法和log-rank检验,多因素生存分析采用多因素Cox分析。结果:1.利用生物信息学方法对GSE56036的miRNA的表达数据进行分析,共获得130个在非小细胞肺癌中存在差异表达的miRNA,其中38个表达上调的miRNA,92个表达下调的miRNA。鉴于hsa-miR-30a-5p的差异倍数和表达丰度较高,选择其进行后续研究。利用TCGA数据库中非小细胞肺癌miRNA表达谱数据和60对临床组织样本中miRNA的表达数据,验证了hsa-miR-30a-5p在非小细胞肺癌中表达下调。本研究分析了hsa-miR-30a-5p表达量与患者临床特征之间的相关性,结果显示,hsa-miR-30a-5p的表达量在不同性别、T分期、N分期和临床分期患者之间的分布具有统计学差异。单因素生存分析分层分析发现,在男性患者中,hsa-miR-30a-5p的表达量与预后相关。多因素生存分析发现,组织病理类型、临床分期与非小细胞肺癌预后相关。2.将非小细胞肺癌细胞系感染慢病毒,从而改变细胞中hsa-miR-30a-5p的表达水平,功能学实验结果显示,与阴性对照组相比,过表达hsa-miR-30a-5p后,非小细胞肺癌细胞增殖能力受到抑制,增殖减慢;细胞凋亡得到促进,凋亡细胞所占比例增加;细胞迁移能力受到抑制,迁移细胞数减少;反之,抑制hsa-miR-30a-5p功能后,非小细胞肺癌细胞增殖能力增强,增殖加快;细胞凋亡受到抑制,凋亡细胞所占比例减小;细胞迁移能力增强,迁移细胞数增多。3.利用TCGA数据分析得到在p53突变个体中hsa-miR-30a-5p表达下调,利用PROMO和Jaspar数据库进行预测,得到p53可能与MIR30A启动子区存在结合位点,应用ChIP实验和PCR验证,p53的确可以直接结合到MIR30A启动子区并促进其转录,从而提高hsa-miR-30a-5p的表达水平。应用TargetScan和starBase等数据库对hsa-miR-30a-5p下游靶基因进行预测,得到SOX4可能是hsa-miR-30a-5p的靶基因,利用TCGA数据,分析得到非小细胞肺癌中hsa-miR-30a-5p与SOX4表达负相关,应用双荧光素酶报告基因实验和Western Blot实验验证,hsa-miR-30a-5p可以直接结合到SOX4的3’-UTR区并抑制SOX4的蛋白表达。回复实验结果表明,SOX4可以部分回复hsa-miR-30a-5p对细胞增殖、凋亡和迁移的影响,进一步说明hsa-miR-30a-5p通过靶向作用于SOX4从而对细胞的生物学行为产生影响。最后,在细胞中过表达SOX4后p53蛋白表达水平增高,说明SOX4可以促进p53蛋白的表达。结论:1.hsa-miR-30a-5p在非小细胞肺癌中表达下调,其表达量与患者T、N分期以及临床分期具有统计学关联,在男性患者中,其表达量与预后相关。2.hsa-miR-30a-5p在非小细胞肺癌中发挥抑癌因子的功能,可以抑制非小细胞肺癌细胞增殖和迁移,促进细胞凋亡。3.hsa-miR-30a-5p上游受到p53的直接调控,下游通过靶向作用于SOX4基因,进而影响非小细胞肺癌细胞的增殖、凋亡和迁移能力,同时,SOX4可以促进p53的表达。p53/hsa-miR-30a-5p/SOX4形成反馈通路调控非小细胞肺癌的增殖、凋亡和迁移。