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背景和目的:BTG2是具有肝组织特异性的、p53诱导的抗增殖抑癌基因,在肿瘤形成过程中它参与了很多重要的生物学功能,如:细胞的分化、抗增殖、促进细胞凋亡、调控细胞周期及DNA损伤修复等,BTG2是肿瘤发生发展信号传导通路中重要的一个调控因子。miRNAs是广泛存在于人类中、发挥重要生物学功能的非编码小RNA,在肿瘤的早期诊断及预后评价方面具有极其重要的临床意义,它主要是通过与靶基因的3’非编码区结合,从而在基因上游水平进行生物学行为的调控;前期我们通过mi RNAs芯片技术和生物学信息分析发现miR-21和mi R-29b在肝细胞肝癌(HCC)中异常表达,与BTG2蛋白水平的异常表达存在明显相关性,故本次研究的目的在于进一步深入探索miR-21和miR-29b调控BTG2蛋白在HCC发生发展过程中的功能和意义,以及探讨其参与调控肝癌细胞生物学行为可能的分子机制,寻找临床上HCC有关诊断、治疗和预后评估等方面新的生物标志分子。方法:1.通过免疫组化、组织芯片技术,结合统计学方法探讨BTG2蛋白表达与HCC生存预后的关系。2.通过qRT-PCR、MTT、检测细胞凋亡、Flow cytometry cell cycle、细胞迁移、划痕及Transwell侵袭实验技术验证mi R-21在肝癌细胞中的表达,及其在肝癌细胞中发挥的生物学作用;通过生物信息学分析、双荧光素酶实验(Dual luciferase report gene system)、构建载体以及蛋白免疫印迹法(WB)予以靶基因验证。3.通过q RT-PCR、MTT、检测细胞凋亡、流式测细胞周期、Transwell侵袭实验技术验证miR-29b在肝癌细胞中的表达,以及它在肝癌细胞中发挥的生物学作用;通过生物信息学分析、双荧光素酶实验(Dual luciferase report gene system)、构建载体以及蛋白免疫印迹法(WB)予以靶基因验证。4.收集肝细胞肝癌病人相关的临床资料及血浆样本共50例、正常人群血浆对照样本12例,应用q RT-PCR(SYBR Green)技术,在统计学方法基础上进一步从临床上验证miR-21和mi R-29b与肝癌患者分期、远处转移及AFP的关系。结果:1.与胃癌、宫颈癌及其癌旁组织相比较,免疫组化显示btg2表达具有肝组织特异性,在hcc癌旁组织中表达呈显著强阳性(+++),表现为胞浆表达;通过组织芯片结果结合临床资料分析提示:btg2单一浆表达的hcc患者其生存期与浆表达强度呈反比,即浆表达越强,生存期越短;若核浆共表达时,以核表达为主的hcc患者生存期较长。2.mir-21在肝癌细胞中较正常肝细胞高表达,抑制mir-21表达能促进肝癌细胞的凋亡,抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭,出现细胞周期阻滞于g2/m期;当过表达mir-21时,btg2蛋白表达下调;当抑制mir-21表达时,btg2蛋白表达增加;证实btg2作为mir-21的直接靶基因,很可能参与了mir-21对肝癌细胞hepg2细胞周期的调控。3.与肝癌细胞相比,mir-29b在正常肝细胞中表达下调,当过表达mir-29b后能明显抑制肝癌细胞侵袭能力,并将细胞阻滞在s期;但mir-29b对肝癌细胞增殖、凋亡未见明显影响;当过表达mir-29b时,btg2蛋白表达下调;当抑制mir-29b表达时,btg2蛋白表达增加;证实mir-29b作为btg2上游的直接靶基因,很可能是通过靶向调控btg2从而产生对肝癌细胞侵袭能力的影响。4.mir-29b在hcc患者的血浆中异常表达,与正常人群对照组相比较其表达显著降低;结合临床资料发现mir-29b与肝癌患者的临床分期(p=0.001)和远处转移(p<0.001)密切相关,与afp未见明显相关性;mir-21在肝癌患者血浆中表达较正常对照组稍有升高,但无统计学差异(p=0.087);结合临床资料发现其与afp有显著相关性(p=0.007),但与肝癌分期、远处转移均未见明显相关性。结论:1.首次发现btg2的表达具有肝组织特异性,在癌旁组织中呈强阳性浆表达;btg2胞浆表达较弱的患者,其生存期显著优于胞浆表达较强的患者;当btg2出现核浆共表达时,以核表达为主的患者生存时间更长,提示btg2可作为hcc预后判定的一个重要生物标志物。2.mir-21在肝癌细胞hepg2中高表达,参与了肝癌细胞的生长、调节肝癌细胞的迁移、侵袭、凋亡能力和细胞周期等主要生物学功能;btg2为mir-21在肝癌中的直接靶基因,并且其蛋白水平与mir-21表达水平呈负相关,推论mir-21可通过直接靶向调控btg2产生对肝癌细胞hepg2的生物学作用。3.在肝癌细胞株hepg2中mir-29b低表达,mir-29b主要参与调控肝癌细胞的周期阻滞及侵袭;mi R-29b作为BTG2的上游靶基因,其表达水平与BTG2蛋白水平呈负相关,提示miR-29b可通过直接靶向调控BTG2影响肝癌细胞的生物学行为。4.mi R-21和mi R-29b在肝癌细胞HepG2中很可能存在对靶基因BTG2的共同交叉调节,其具体机制还需进一步深入探讨。5.与正常人群相比,肝细胞肝癌病人血浆中mi R-29b和mi R-21的表达水平呈下调和上调趋势,miR-21的表达水平与AFP呈正相关;miR-29b与肝癌分期及远处转移状态呈负相关,提示mi R-21、mi R-29b可能作为HCC早期诊断、分期和远处转移的生物标志物,为HCC诊断、疗效评估和预后相关生物标志物的筛选奠定了一定的理论依据。