糖尿病是一种与环境、饮食等多因素相关的代谢性疾病,包括绝对胰岛素缺乏的Ⅰ型糖尿病、胰岛素抵抗背景下β细胞胰岛素分泌逐渐丧失的Ⅱ型糖尿病及妊娠糖尿病等其他特殊类型。胰岛β细胞功能损伤是Ⅰ、Ⅱ型糖尿病共有的病理基础。吸烟是糖尿病首要危险因素之一。吸烟能引起血清中促炎症因子增多且能通过引起胰腺等组织炎症浸润,进一步放大炎症并释放蛋白酶,从而引起胰岛β细胞凋亡,损伤其功能,造成胰岛素分泌异常。尽管基于广泛的流行病学调查显示,吸烟是胰岛β细胞功能损伤的独立风险因素,但其确切的致病机制尚不清楚。此外,由于吸烟引起慢性炎症所致糖尿病患者数目逐年增涨,除常规的糖尿病药物外,至今仍缺乏有效的干预措施。非编码RNA(ncRNAs),如长链非编码RNA(lncRNAs)和微小RNA(miRNAs)在人类多种疾病的发生发展过程中具有重要调控作用。lncRNA可通过吸附miRNA影响靶基因功能。尽管若干研究已表明吸烟会通过引起炎症浸润影响胰腺ncRNAs表达,并在糖尿病的发展和进程中发挥重要作用,但其确切功能仍有待进一步研究。同时,基于穿心莲内酯抑制炎症的特性,其对吸烟引起的胰岛β细胞功能损伤及糖尿病的干预作用前景广阔。因此,深入研究ncRNA在吸烟所致胰岛β细胞功能损伤及糖尿病中的作用,评价穿心莲内酯对吸烟所致胰岛β细胞功能损伤的干预效果,对于阐明吸烟所致糖尿病分子机制,寻找新的治疗靶点具有重要的理论意义和一定的实用价值。第一部分 lncRNA MALAT1调控miR-17在CSE所致胰岛β细胞功能损伤中的作用目的探讨CSE对MIN6细胞炎性因子分泌,胰岛素分泌能力及胰岛素合成相关基因表达的影响。方法使用0、20、40或80μg/mL CSE处理MIN6细胞24 h;分别用50 nM miR-17 mimic或miR-NC转染预处理MIN6细胞24 h后,再使用40μg/mL CSE处理MIN6细胞24 h;分别用100 nM lncRNA MALAT1的siRNA或Con siRNA转染预处理MIN6细胞24 h后,再使用40μg/mL CSE处理MIN6细胞24 h;分别用100 nM lncRNA MALAT1的siRNA或Con siRNA与miR-17 mimic或miR-NC共转染预处理MIN6细胞24 h后,再使用40μg/mL CSE处理MIN6细胞24 h等处理方法;体外实验观察CSE所致胰岛β细胞损伤,建立体外暴露模型,应用ELISA观察MIN6细胞炎性因子IL-6及IL-1β分泌水平;ELISA观察葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)能力;Western Blots检测胰岛素合成相关蛋白mafA、TXNIP表达水平;qRT-PCR检测细胞lncRNA MALAT1及miR-17的表达情况;荧光素酶报告基因检测miR-17与lncRNA MALAT1结合情况;应用miR-17 inhibitor或mimic、lncRNA MALAT1 siRNA等干涉技术探讨lncRNA MALAT1调控miR-17在CSE所致胰岛β细胞功能损伤中的作用。结果一、CSE对MIN6细胞胰岛素分泌及合成和炎性因子的影响结果发现MIN6细胞IL-6、IL-8分泌水平,GSIS能力及胰岛素合成抑制因子TXNIP表达随CSE处理剂量增加而逐渐升高,MIN6细胞胰岛素转录因子mafA表达随CSE处理剂量增加而逐渐减少。提示CSE能够引起MIN6细胞胰岛素分泌及合成减少并引起炎性因子释放增多。二、CSE对MIN6细胞miR-17及lncRNA MALAT1水平的影响结果发现MIN6细胞lncRNA MALAT1水平升高及miR-17水平降低,且均具有剂量-效应关系;并利用microRNA靶基因预测软件分析发现TXNIP 3’-非编码区(UTR)存在miR-17的结合位点。提示lncRNA及miRNA在吸烟所致胰岛β细胞功能损伤中发挥重要作用。三、miR-17在CSE所致胰岛β细胞功能损伤中的作用结果发现miR-17与负调控胰岛素合成的基因TXNIP有稳定结合的位点;miR-17 mimic可以阻滞CSE所致MIN6细胞GSIS能力减弱;且能阻滞CSE所致MIN6细胞TXNIP表达水平升高,mafA表达水平降低。结果提示miR-17在CSE所致胰岛β细胞损伤中起作用。四、lncRNAMALAT1在CSE所致胰岛β细胞功能损伤中的作用结果发现lncRNA MALAT1与miR-17有稳定结合的位点;miR-17 mimic与PGL3-MALAT1-WT共转染后联合40μg/mL CSE处理MIN6细胞后荧光素酶活性显著低于单独CSE处理组;下调lncRNA MALAT1表达可引起miR-17水平升高,并阻滞CSE所致MIN6细胞GSIS能力减弱和TXNIP表达水平升高,mafA表达水平降低。提示CSE可通过lncRNA MALAT1影响胰岛β细胞功能。五、lncRNA MALAT1调控miR-17在CSE所致胰岛β细胞功能损伤中的作用结果发现与单独下调lncRNA MALAT1联合CSE处理组相比,lncRNA MALAT1 siRNA与miR-17抑制剂交互联合CSE处理组GSIS能力减弱,TXNIP表达水平升高,mafA表达水平降低。证明CSE可以通过引起lncRNA MALAT1高表达,调控miR-17,影响其下游TXNIP及mafA水平,导致胰岛素合成减少,胰岛β细胞功能受损。小结CSE引起MIN6细胞炎症因子水平升高,诱导lncRNA MALAT1水平升高,从而引起miR-17水平降低,以解除对TXNIP的抑制从而引起mafA减少,胰岛素合成被抑制。第二部分 穿心莲内酯对CSE所致胰岛β细胞功能损伤的干预作用目的对穿心莲内酯在CSE所致胰岛β细胞功能损伤的干预作用进行评估,也为可能的机制进行初步的探索。方法分别用0、1、2.5或5μM穿心莲内酯预处理MIN6细胞24 h后,再使用40μg/mL CSE处理MIN6细胞24 h,以建立穿心莲内酯干预细胞模型。应用ELISA观察MIN6细胞炎性因子IL-6及IL-1β分泌水平;ELISA观察GSIS能力;Western blots检测胰岛素合成相关蛋白mafA、TXNIP表达水平及凋亡相关蛋白Caspase-3、Cleaved Caspase-3表达水平,在细胞水平探讨抗炎药物穿心莲内酯对CSE所致胰岛β细胞功能损伤中的干预效果。结果一、穿心莲内酯对CSE所致MIN6细胞炎性因子分泌增多的影响结果发现与单独CSE处理组相比,单独穿心莲内酯处理不影响MIN6细胞炎性因子IL-6及IL-1β分泌水平;与单独CSE处理组相比,穿心莲内酯预处理联合40μg/mL CSE处理组MIN6细胞IL-6及IL-1β分泌水平降低,且对IL-6分泌水平的影响具有较明显的剂量-效应关系。结果提示穿心莲内酯可以阻滞CSE所致MIN6细胞炎性因子水平升高。二、穿心莲对CSE所致MIN6细胞胰岛素合成及分泌减少的影响结果发现与单独CSE处理组相比,单独穿心莲内酯处理不影响MIN6细胞GSIS能力;与单独CSE处理组相比,穿心莲内酯预处理联合40μg/mL CSE处理组MIN6细胞GSIS能力回升及TXNIP表达水平降低,mafA表达水平升高。结果提示穿心莲内酯可以阻滞CSE所致MIN6细胞胰岛素合成减少。三、穿心莲对CSE所致MIN6细胞凋亡相关蛋白升高的影响结果发现与单独CSE处理组相比,单独穿心莲内酯处理不影响MIN6细胞Caspase-3及Cleaved Caspase-3蛋白表达水平;与单独CSE处理组相比,穿心莲内酯预处理联合40μg/mL CSE处理组MIN6细胞总Caspase-3水平不变,Cleaved Caspase-3水平降低,且具有剂量效应关系。结果提示穿心莲内酯可以阻滞CSE所致MIN6细胞凋亡。小结穿心莲内酯可阻滞CSE所致MIN6细胞炎性因子释放和胰岛β细胞功能损伤(胰岛素合成减少及凋亡增多)。表明抗炎药物穿心莲内酯对CSE所致胰岛β细胞功能损伤具有干预作用。第三部分 香烟烟雾暴露对小鼠胰岛β细胞功能的影响及穿心莲内酯的干预作用目的进一步从动物水平验证CS暴露通过引起炎症浸润及炎性因子的释放对胰岛β细胞功能的影响,并在动物水平探讨穿心莲内酯的干预作用。方法4周龄(体重20g左右)健康C57BL/6小鼠,随机分为3组,即对照组、CS暴露组、CS联合穿心莲内酯处理组。建立CS暴露诱导小鼠胰岛β细胞功能损伤模型及穿心莲内酯干预模型。小鼠每周5天置于全身暴露系统,暴露于500mg/m~3总颗粒物的1R4FCS1 h,4 h后重复暴露一次,连续暴露12周。穿心莲内酯干预组小鼠以100 mg/kg剂量腹腔内注射,每周3次,每次隔一天。应用腹腔葡萄糖注射试验(IPGTT)、空腹血糖评价小鼠糖代谢;ELISA检测血清胰岛素及IL-6、IL-1β分泌水平;免疫组化检测胰岛炎症浸润及胰岛素水平;TUNEL染色检测胰岛β细胞凋亡水平;Western Blots检测胰岛Caspase-3及Cleaved Caspase-3表达水平。研究CS暴露通过引起炎症浸润及炎性因子的释放对胰岛β细胞功能的影响,并在动物水平探讨了穿心莲内酯的干预作用。结果一、CS暴露对小鼠糖代谢紊乱的影响及穿心莲内酯的干预作用结果发现,CS和穿心莲内酯均不影响小鼠体重,然而CS引起空腹血糖水平升高,进一步通过IPGTT实验发现,CS损害小鼠葡萄糖清除能力;而与CS组相比,穿心莲内酯有效抑制了CS所致小鼠空腹血糖升高,以及葡萄糖清除率降低。提示穿心莲内酯能够拮抗CS暴露所致高血糖症。二、CS暴露对小鼠炎症浸润炎性因子释放的影响及穿心莲内酯的干预作用结果发现,CS引起胰腺中尤其是胰岛巨噬细胞表面标志物CD68增多,血清中炎性因子IL-6、IL-1β及TNF-α水平显著升高;而穿心莲内酯联合CS处理的小鼠,胰岛炎症细胞浸润及血清炎性因子释放均得到一定程度抑制。提示穿心莲内酯能够拮抗CS暴露所致炎症浸润及炎性因子释放。三、CS暴露对小鼠胰岛β细胞的影响及穿心莲内酯的干预作用结果发现,CS引起血清胰岛素减少、胰岛面积减小、胰岛素阳性β细胞减少、胰岛凋亡小体增多,Cleaved Caspase-3水平升高;而穿心莲内酯联合CS处理的小鼠,胰岛素量减少、胰岛面积减小、胰岛β细胞数量减少、胰岛凋亡小体增多、Cleaved Caspase-3水平升高均得到一定程度抑制。提示穿心莲内酯能够拮抗CS暴露所致胰岛β细胞胰岛素合成减少和胰岛β细胞凋亡,对胰岛β细胞功能具有一定保护作用。小结CS暴露可引起小鼠胰岛β细胞胰岛素合成减少、胰岛β细胞发生炎症和凋亡;穿心莲内酯则可明显拮抗CS暴露所致的这些效应。提示抗炎药物穿心莲内酯可一定程度拮抗CS暴露所致小鼠胰岛β细胞功能损伤,糖尿病发生。第四部分 lncRNA MALAT1和miR-17在不同程度吸烟人群血清中水平及意义目的探讨不同吸烟程度的人群血清炎症因子变化、糖尿病指标变化及其与lncRNA MALAT1和miR-17水平的关系。方法在已建立的人群队列中,将不同程度吸烟人群按吸烟的包年数(平均包数/天×吸烟年数)分为不吸烟组、轻度吸烟组、中度吸烟组和重度吸烟组。流行病学调查收集基础资料及糖尿病相关指标,计算HOMA‐IR及HOMA-β;利用BD-CBA人血清炎症因子检测试剂盒,检测血清炎症因子表达情况;利用qRT-PCR检测血清lncRNA MALAT1及miR-17水平。结果一、吸烟对糖尿病相关指标的影响对不同程度吸烟者糖尿病相关指标调查发现,与非吸烟者相比,吸烟者的空腹血糖、HbA1c显著升高,且平均值高于诊断标准,且随吸烟包年数的升高,呈现较低的HOMA-β值。提示吸烟可导致葡萄糖代谢异常并减弱β细胞功能。二、吸烟对血清炎性因子分泌水平的影响对不同程度吸烟人群调查发现,随着吸烟年包数的增加,血清炎性因子TNF-α水平显著升高,重度吸烟者IL-6、IL-8、IL-1β水平显著升高。提示吸烟可能引起血清炎性因子水平升高,产生慢性炎症。三、吸烟对血清lncRNA MALAT1和miR-17水平的影响对不同程度吸烟人群调查发现,吸烟引起血清lncRNA MALAT1水平升高而miR-17水平减低;进一步通过线性回归分析,发现血清lncRNA MALAT1水平与空腹血糖之间呈正相关关系;而miR-17水平与空腹血糖呈负相关关系。提示血清lncRNA MALAT1与miR-17水平改变可能与吸烟所致胰岛β细胞功能损伤有关。小结吸烟引起血清炎性因子分泌增多,产生慢性炎症;引起血清lncRNA MALAT1水平升高而miR-17水平降低;且其变化与空腹血糖升高相关。综上所述,本研究主要发现:1.CSE可以引起MIN6细胞炎症因子水平升高,诱导lncRNA MALAT1水平升高,从而引起miR-17水平降低解除对TXNIP的抑制从而引起mafA减少,胰岛素合成被抑制。2.穿心莲内酯可有效拮抗CSE所致MIN6细胞炎性因子释放、胰岛素合成减少及凋亡增多,表明抗炎药物穿心莲内酯对CSE所致胰岛β细胞功能损伤具有干预作用。3.CS暴露可引起小鼠空腹血糖升高、腹腔注射葡萄糖耐量受损;胰岛发生炎症反应;胰岛β细胞功能损伤;且穿心莲内酯通过抗炎作用拮抗CS暴露所致胰岛β细胞功能损伤。4.吸烟引起血清炎症因子水平升高,引起胰岛β细胞功能损伤及血清lncRNA MALAT1水平升高和miR-17水平降低。