论文部分内容阅读
背景:类风湿关节炎(RheumatoidArthritis,RA)是一种慢性自身免疫性疾病,临床表现为慢性、对称性、多关节炎症。RA属中医“痹症”,机体正气虚弱,风寒湿热侵袭,气血经络闭阻引发“痹症”。艾灸是中医传统外治法之一,具有通经活络、行气活血的功效。根据古代文献记载,艾灸很早就应用于治疗痹症。现代研究也表明,艾灸可以改善类风湿关节炎的病理状态,降低血清中白细胞介素-1β(Intrleukin-1β,IL-1β)与肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)等的表达水平。本课题组前期采用蛋白质组学比较了艾灸治疗RA大鼠组织及血清蛋白质的变化,为探讨艾灸治疗RA的效应机制奠定了基础。与蛋白组学相比,代谢组学以代谢的终产物为研究对象,能够反映人体活动的最终结果。基于以上研究,本实验借助代谢组学气相色谱质谱(Gas Chromatography-mass Spectrometry,GC-MS)技术,探讨艾灸治疗 RA 密切相关的代谢产物及可能的代谢途径,揭示艾灸治疗RA的作用机制。目的:大鼠建立胶原诱导(Collagen-inducedArthritis,CIA)模型,评价艾灸对CIA大鼠的体重、足趾肿胀程度、关节炎指数评分(Arthritis Index,AI)、相关炎性细胞因子以及足踝关节病理组织的影响。借助GC-MS代谢组学技术,分析艾灸对CIA大鼠血清与滑膜组织代谢谱的变化。探讨其治疗CIA大鼠可能的作用机制。方法:(1)24只雄性SD(Sprague Dawley)大鼠按随机数字表法分为对照组、模型组、艾灸组,每组8只。模型组与艾灸组大鼠建立Ⅱ型CIA模型。模型复制成功后,艾灸组给予艾条灸双侧“肾俞”、“足三里”穴,每天1次,连续6天为1个疗程,共3个疗程,疗程间休息1天。(2)大鼠基线比较:比较造模前3组大鼠体重、左足足趾容积大小。(3)大鼠体重比较:比较大鼠艾灸前后,体重差异。(4)大鼠足趾容积比较:比较大鼠艾灸前后,左足足趾容积差异。(5)AI评分:观察治疗前模型组与艾灸组大鼠,AI评分的差异;疗程结束后,模型组与艾灸组大鼠,AI评分的差异。(6)TNF-α、IL-1β、前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2):疗程结束后,收集各组大鼠血清,采用酶联免疫吸附剂测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA),比较 3 组大鼠血清中 IL-1β、TNF-α、PGE27水平。(7)大鼠踝关节病理组织:疗程结束后,随机收集每组大鼠中2只大鼠的左侧踩关节进行病理组织学观察。(8)疗程结束后,收集3组大鼠血清与滑膜组织标本。应用GC-MS联合多元统计学分析3组大鼠血清、滑膜组织的代谢指纹图谱信息。使用MetaboAnalyst3.0及相关数据库,探讨治疗过程中涉及的代谢产物与代谢通路。结果:(1)基线比较:3组大鼠造模前体重与足趾容积无统计学差异(P>0.05)。(2)体重比较:3组大鼠造模前,体重无统计学差异(P>0.05)。造模成功后,模型组与对照组相比,模型组与艾灸组体重增长缓慢,差异有统计学意义(P<0.05),艾灸组与模型组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。艾灸干预结束后,与对照组相比,模型组与艾灸组体重增长缓慢,(P>0.05),艾灸组与模型组相比,艾灸组大鼠体重质量高于模型组,P<0.05。(3)足趾容积比较:造模前,3组大鼠足趾容积无统计学差异(P>0.05),基线具有可比性。造模成功后,艾灸干预前,与对照组相比,模型组与艾灸组大鼠足趾容积明显增长,差异具有统计学意义(P<0.05),模型组与艾灸组大鼠足趾容积无统计学差异(P>0.05)。艾灸干预结束后,与对照组相比,模型组与艾灸组足趾容积增长明显,P<0.05,艾灸组与模型组相比,艾灸组足趾容积下降明显,P<0.05。(4)AI评分比较:造模成功后,模型组与艾灸组大鼠AI评分均大于4分,艾灸组与模型组AI评分差异无统计学意义(P>0.05),基线具有可比性。艾灸干预结束后,艾灸组AI评分较模型组下降,P<0.05。(5)炎症因子:IL-1β水平:疗程结束后,模型组与对照组相比,模型组血清IL-1β 水平升高明显,P<O.05,艾灸组与模型组相比,艾灸组血清IL-1β水平下降,P<0.05。TNF-α水平:艾灸干预结束后,模型组与对照组相比,模型组血清TNF-α水平升高,P<0.05,艾灸组与模型组相比,艾灸组血清TNF-α水平下降,P<0.05。PGE2水平:艾灸干预结束后,模型组与对照组相比,模型组血清PGE2水平上升,P<0.05,艾灸组与模型组相比,艾灸组血清PGE2水平下降,P<0.05。(6)大鼠踝关节组织病理苏木精和伊红(Hematoxylin and Eosin,HE)染色:对照组大鼠踝关节组织结构清晰,踝关节组织表面光滑,无滑膜细胞病变,无炎细胞浸润;模型组大鼠踝关节出现组织滑膜细胞变性、滑膜下组织纤维组织增生,炎细胞浸润;艾灸组大鼠踝关节组织仅出现滑膜增厚。(7)血清代谢组学分析:模型组与对照组相比,模型组大鼠血清中的苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、牛磺酸、苯丙氨酸的浓度升高,柠檬酸浓度下降(P<0.05)。艾灸组与模型组相比,大鼠血清中丝氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、牛磺酸浓度下降,柠檬酸浓度上升(P<0.05),其余代谢物水平均有降低的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。(8)滑膜组织代谢组学分析:模型组与对照组相比,模型组大鼠滑膜组织中的赖氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸的浓度升高,岩芹酸、胱硫醚、胆固醇的浓度下降(P<0.05)。艾灸组与模型组相比,大鼠滑膜组织中缬氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、苯丙氨酸浓度下降(P<0.05),岩芹酸、胆固醇浓度上升(P<0.05)。其余代谢物,模型组与艾灸组差异无统计学意义(P>0.05)。(9)代谢通路:筛选出的差异代谢物共涉及代谢通路16条,分别是缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸生物合成;D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢;甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸代谢;苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸生物合成;丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢;牛磺酸和亚牛磺酸代谢;甲烷代谢;苯丙氨酸代谢;乙醛酸和二羧酸代谢;半胱氨酸和蛋氨酸代谢;原发性胆汁酸生物合成;精氨酸和脯氨酸代谢;谷胱甘肽代谢;柠檬酸循环(TCA循环);类固醇生物合成;氨酰-tRNA生物合成。结论:(1)本研究中,艾灸可以改善CIA大鼠的体重、足趾容积与AI评分。艾灸也可以降低CIA大鼠血清IL-1β、TNF-α与PGE2水平。艾灸组大鼠踝关节病理观察仅出现滑膜增厚现象。大鼠的皮毛、饮食、活动、关节功能、组织滑膜的病理情况、炎症和免疫情况,经艾灸干预后皆有改善。(2)CIA造模后大鼠血清、滑膜组织代谢发生了明显变化,可以筛选出类风湿关节炎发病相关的潜在代谢标记物及其相关代谢通路。(3)艾灸可以使CIA大鼠血清、滑膜组织中异常变化的代谢物水平有不同程度的恢复,这些筛选出的代谢物可以作为潜在艾灸治疗RA的作用靶点。