第一部分、IL-1β和TNF-α诱导神经损伤的机制及谷氨酰胺酶的作用探讨　　神经炎症反应在神经退行性疾病等发病过程中起重要的作用，可能是它们的诱发因素之一，而细胞因子(IL-1β、TNF-α)则是神经炎症反应的主要介导者。目前，炎症反应介导神经损伤的具体机制尚有待于进一步的探索。已有的研究表明，在病理情况下，过高浓度的谷氨酸将引起神经兴奋性毒性并导致神经元的损伤和死亡。谷氨酰胺酶是一种在细胞内催化谷氨酰胺生成谷氨酸的关键酶，因此，它与谷氨酸可能在炎症反应介导的神经损伤过程中扮演重要的角色。　　通过观察体外培养的胚胎神经元细胞在细胞因子IL-1β、TNF-α作用下的形态学及分子水平的变化等，我们将探讨细胞因子诱导神经毒性的具体机制及谷氨酰胺酶和谷氨酸在此过程中的作用。　　鉴于中枢神经系统内的谷氨酰胺酶主要为肾型谷氨酰胺酶(kidney-typeglutaminase，KGA)，在使用IL-1β、TNF-α对人神经元细胞进行刺激后，我们采用免疫组化荧光染色观察了肾型谷氨酰胺酶的表达变化情况。肾型谷氨酰胺酶的表达量在细胞因子IL-1β、TNF-α处理后均有不同程度的增加。随后的Real-timePCR及Westernblotting结果证实了IL-1β和TNF-α的刺激上调了KGA的mRNA及蛋白质水平。本研究也证实，IL-1β、TNF-α将导致谷氨酰胺酶的定位发生改变。IL-1β、TNF-α均能够诱导该酶从线粒体释放到细胞胞浆内，此外，TNF-α还能够使谷氨酰胺酶从细胞内释放到细胞培养的上清中。随后的实验还证明了细胞因子的处理可以上调人神经元细胞内的谷氨酸浓度。通过RP-HPLC检测，我们也发现在IL-1β、TNF-α刺激大鼠神经元之后，其培养上清中的谷氨酸浓度较未处理组显著增高(p＜0.001)，而且这种浓度变化可以被NMDA受体的阻断剂(MK801)所阻止。MAP-2染色法和MAP-2ELISA的结果显示，细胞因子的刺激导致人神经元细胞的突触受损。此外，TUNEL法检测人神经元细胞后发现，IL-1β、TNF-α的处理诱导了细胞凋亡的发生(p＜0.05)。　　本研究首次证实，IL-1β、TNF-α刺激人神经元细胞后诱导谷氨酰胺酶量的增加，并上调细胞内外的谷氨酸浓度，同时激活谷氨酸离子型受体（NMDA受体）并导致细胞活力下降。该研究还证实，使用高浓度的炎性细胞因子处理人神经元细胞后，不仅提高了细胞内外的谷氨酸浓度，还导致人神经元细胞的突触出现不同程度的受损，并引起细胞凋亡。鉴定出谷氨酰胺酶在炎症反应过程中的重要作用将会给神经退行性疾病的治疗提供一个新的治疗靶标。　　第二部分、IL-1β和TNF-α影响神经发生及miRNA-124的作用探讨　　神经发生在发育的过程中发生得很迅速，且终生在成年哺乳动物的海马区和嗅球处活跃。神经元的再生过程受到很多因素的调节，包括各种激素、炎性细胞因子（IL-1β、TNF-α等）、能够抑制靶基因转录的微小RNA(miRNA)等。miRNA-124是大脑内含量最为丰富的miRNA，它的主要功能是抑制星形胶质细胞的分化，促进神经特异性基因的转录，并且刺激神经突触在神经祖细胞的分化过程中生长。同时，它对成熟神经元细胞的性状维持也非常重要。　　鉴于炎性细胞因子对神经发生的抑制作用和miRNA-124对神经发生的促进作用，我们将采用炎性细胞因子IL-1β、TNF-α来模拟炎症反应过程，并研究它们如何影响神经发生，同时探讨miRNA-124在此过程中的作用。　　我们实验室前期的miRNA基因芯片结果显示，miRNA-124的表达水平在神经祖细胞分化为神经元和星形胶质细胞的过程中逐渐增加。分化第1天后，miRNA-124的变化并不明显;但是当分化进行到第7天时，神经元分化组的miRNA-124表达水平较未分化的神经祖细胞显著增加(p＜0.01)，而星形胶质细胞组的miRNA-124较未分化组略微增加。我们的Real-timePCR结果证实了基因芯片数据中神经元分化部分的结果。在采用炎性细胞因子IL-1β或TNF-α刺激分化的神经祖细胞后，我们成功诱导了神经炎症反应。细胞因子的刺激使神经分化的标志物(MAP-2)的mRNA和β-Ⅲ-tubulin的蛋白水平下调，此外，神经胶质化的标志物(GFAP)的mRNA及其蛋白水平被显著上调(p＜0.01)，证明细胞因子明显抑制了神经发生并促进了神经胶质化进程。随后的Real-timePCR结果显示，细胞因子的处理使miRNA-124的表达水平在神经祖细胞的分化过程中较未处理组明显降低(p＜0.01)。同时，Real-timePCR和Westernblotting的结果也证明了miRNA-124下游的靶基因代表-STAT3及SOX9的mRNA、蛋白质水平均显著上调(p＜0.05）。通过转染miRNA-124的质粒进行过表达后，分化细胞中的miRNA-124水平在分化后第4天较对照组显著上调(p＜0.001)。Real-timePCR的检测结果显示，过表达miRNA-124后，其下游靶基因STAT3及SOX9的mRNA、蛋白质水平均显著下调(p＜0.05)。　　总之，我们首次证实了miRNA-124在人神经祖细胞的分化模型中与神经发生密切相关。在神经祖细胞的正常分化过程中，miRNA-124的表达水平逐步增加，而细胞因子IL-1β、TNF-α的处理则导致miRNA-124的表达水平显著下降。同时，miRNA-124的下游靶基因也出现相应变化，SOX9的表达量上调及STAT3被活化。当过表达miRNA-124后，STAT3及SOX9的mRNA、蛋白质水平均显著下调。研究miRNA-124在炎症反应中的作用，对提高炎症相关的疾病中的神经发生水平起重要的指导作用，此外，还可以防止过度神经胶质化的出现。　　第三部分、TIGAR基因在肝癌细胞凋亡和自体吞噬中的调控作用探讨　　目的:探讨TIGAR基因对人肝癌细胞Hep3b、HepG2的凋亡和自体吞噬的调控。　　方法:体外培养肝癌细胞Hep3b、HepG2，采用Real-timePCR和westernblotting检测TIGARsiRNA的干扰效率;Annexin(V)-PI染色检测细胞凋亡;MDC荧光染色观察TIGARsiRNA处理后HepG2细胞的自噬泡形成;透射电镜观察HepG2细胞的亚显微结构;westernblotting检测LC3Ⅱ的表达水平。　　结果:在体外实验中，合成的4对TIGARsiRNA(干扰位点分别为80、225、496、772)的干扰效率有明显差异，其中siTIGAR80在Hep3b和HepG2中的干扰效率均在50％左右;siTIGAR772的干扰效果最好（Hep3B-约60％;HepG2-约75％）;而siTIGAR225及496的干扰效果都明显较其它两个差。TIGARsiRNA干扰TIGAR的表达后，可以诱导Hep3b和HepG2细胞的凋亡。此外，TIGARsiRNA在HepG2细胞中还可以诱导自噬活性的显著增加，出现了与阳性对照组相似的自噬泡结构。TIGAR基因的表达下调也导致LC3Ⅱ蛋白的表达水平增加。而3-MA的预处理则可以阻止TIGARsiRNA诱导的自噬。　　结论:TIGARsiRNA在体外可以有效地提高Hep3b、HepG2细胞的凋亡率，但是对Hep3b的作用要小于HepG2。TIGAR基因参与了肝癌细胞的凋亡和自噬调控，抑制其表达可以有效地提高肝癌细胞的凋亡率和自噬率。