对虾白斑综合症病毒启动子文库的构建及极早期基因的筛选

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在病毒感染的过程中,病毒基因的转录是由宿主以及病毒编码的转录因子共同调控的。目前人们对对虾白斑综合症病毒(White spot syndrome virus,WSSV)基因的转录调控机制了解的还比较有限。为了提供用于病毒基因转录调控研究的一个平台,本论文构建了对虾白斑综合症病毒的启动子文库。该文库包含了WSSV基因组中154个开放阅读框(open reading frame,ORF)上游约500 bp调控区序列。这些调控区都被克隆到PIZΔ IE/V5-EGFP载体中,连接在报告基因EGFP的上游。这一启动子文库可以用于研究宿主和病毒的蛋白对WSSV基因转录的调控。为了对WSSV基因启动子的性质有个初步的了解,我们将文库中的154个质粒分别转染到High-five细胞中,并检测报告基因的表达。结果表明,其中17个WSSV启动子区可以在high-five细胞中激活下游基因的转录。这些启动子区分别是:wsv045P,wsv119P,wsv172P,wsv188P,wsv192P,wsv207P,wsv226P, wsv260P, wsv285P, wsv299P, wsv343P, wsv407P, wsv447P, wsv482P,wsv486P,wsv489P,wsv513P。而其余的137个启动子区则不能在high-five细胞中激活下游基因的表达。进一步的分析表明,在17个表现出活性的启动子中,有15个含有TATA box;同时,CCACCC序列在这些启动子上出现的频率也很高。   此外,上述17个WSSV基因启动子能够被宿主的转录因子所启动,符合病毒极早期基因转录的特征。RT-PCR分析表明,其中11个基因,wsv119,wsv172,wsv188, wsv207, wsv226, wsv285, wsv299, wsv343, wsv447, wsv482, wsv489在蛋白质合成抑制剂CHX存在下依然能够转录,说明它们属于WSSV的极早期基因。在此基础上,我们分析了已发现的20个极早期基因在血细胞和造血组织细胞表达上的差异。结果表明,在CHX存在的情况下,所有20个待测基因都可以在造血组织细胞中转录,而只有8个能够在原代血细胞中转录。提示了WSSV在宿主不同组织的感染增殖情况存在一定的差异。
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