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目的:检测Pokemon基因在结直肠癌组织和SW480细胞中的表达情况;构建Pokemon siRNA干扰载体,瞬时转染SW480细胞,以实现siRNA表达载体对SW480细胞Pokemon原癌基因的抑制,以期进一步探讨Pokemon基因在肿瘤发生过程中的分子机制并寻找肿瘤基因治疗的新靶点。方法:1.应用半定量RT-PCR技术检测Pokemon mRNA在46例结直肠癌及癌旁对照组织中的相对表达量;利用免疫组织化学染色显示POKEMON蛋白在结直肠癌及对照组织中的表达和定位;2.构建靶向抑制Pokemon原癌基因的短发夹双链RNA(shRNA)的真核表达载体pGshRNA-Pokemon;3.应用半定量RT-PCR技术验证Pokemon mRNA在SW480细胞中的表达量;利用间接免疫荧光技术观察POKEMON蛋白在SW480细胞中的表达和定位;4.通过脂质体介导转染SW480细胞,镜下观察转染效率和细胞形态的变化;应用实时荧光定量PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测siRNA表达载体对Pokemon基因的抑制情况,并筛选获得发挥最佳抑制效果的Pokemon siRNA干扰载体;5.流式细胞术分析Pokemon干扰载体转染后SW480细胞的凋亡变化。结果:1.结直肠癌组织中Pokemon mRNA的表达水平(0.845±0.174)显著高于癌旁组织(0.321±0.087),两组之间差异具有显著的统计学意义(P﹤0.05);POKEMON蛋白定位在癌细胞胞质与胞核中,以胞质为主,阳性表达率为87%;癌旁组织POKEMON蛋白的阳性表达率为19.6%,以腺上皮细胞胞核弱阳性着色为主。结直肠癌组织中POKEMON蛋白的阳性表达率显著高于癌旁组织(χ2=41.961, P﹤0.01);2.酶切鉴定和DNA序列分析表明Pokemon siRNA表达载体构建成功;3.半定量RT-PCR显示SW480细胞中Pokemon mRNA处于高水平表达;间接免疫荧光结果显示POKEMON蛋白在SW480细胞中主要定位在胞质中,胞核内也偶有表达;4.瞬时转染24 h后转染效率大约为50%,与阴性对照组相比,干扰组SW480细胞生长受抑,形态发生明显变化。实时荧光定量PCR分析表明:与阴性对照组相比,转染Pokemon siRNA表达载体后24 h、48 h、72 h Pokemon mRNA水平均受到明显抑制,其中干扰质粒P2的抑制效率最高,在48 h时可达83.1%;Western blot结果显示:干扰质粒P2在转染后48 h、72 h、96 h对POKEMON蛋白的表达均有明显抑制,在72 h的抑制率最高,可达73.49%;5.流式细胞仪分析显示转染Pokemon siRNA表达质粒后SW480细胞凋亡增加。结论:原癌基因Pokemon在结直肠癌中高表达,很可能与结直肠癌的发生、发展密切相关。成功构建的pGshRNA-Pokemon干扰载体对SW480细胞中Pokemon mRNA和蛋白表达具有显著抑制效果,Pokemon基因沉默可促进SW480细胞凋亡增加。这些结果为后续进一步研究Pokemon基因在结直肠癌发病机制中的作用奠定了前期实验基础。