研究背景及目的近年来国内外因职业性接触三氯乙烯(Trichloroethylene,TCE)而引起中毒的事件屡见报道,其中以职业性三氯乙烯药疹样皮炎(Occupational Medicamentosa-Like Dermatitis induced by Trichloroethylene, OMLDT)居多。自1988年以来广东省先后在TCE接触工人中发现以严重皮损、发热、肝功能损害和浅表淋巴结肿大为表现的病例,至2009年已有394例,并且每年约有20例新发病例出现,被动接触人群也是逐年增加。该病起病急、易误诊、后果严重,现有预防措施效果不理想,己成为我国职业病危害的新问题。但目前其发病机制仍不明确,而且缺乏有效的疾病诊断和监测的生物学手段。因此,阐明其发病机制、寻找早期诊断生物标志以及治疗靶标具有重要的理论价值和现实意义。目前OMLDT已成为研究者关注的热点问题。研究内容主要集中在临床病例分析、回顾性职业流行病学调查、疾病易感基因多态性、免疫损伤机制等方面,但这些研究结果尚处于基础研究阶段,尚未在人群中验证,因此还无法作为有效的防治手段应用于实际工作。越来越多的证据表明血清中的蛋白质/多肽常常是疾病的诊断标志,是获得生物标志的丰富资源之一。研究疾病与健康状态下血清蛋白质的差异,将有助于寻找关键蛋白和标志蛋白,对于阐明疾病发生机制、寻找早期生物监测指标以及药物治疗靶标具有重要意义。本研究应用功能磁珠、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF-MS)和ClinProTools生物信息学方法分离和筛选OMLDT患者发病各时期血清样本,建立OMLDT诊断模型,并分析其中蛋白质/多肽变化情况以了解整个病程中不同时期血清蛋白/多肽的动态变化规律,有望找到差异蛋白/多肽,为临床早期诊断和筛选高危人群提供参考。方法1、研究对象2009年12月至2011年10月共收集21例(?)OMLDT患者、64例职业性TCE接触工人、56例正常人用于临床调查研究；筛选18例OMLDT患者、29例职业性TCE接触工人、29例正常人用于OMLDT诊断模型的建立和验证；7例OMLDT典型患者用于动态变化研究。2、临床调查研究对21例OMLDT患者临床资料和临床检测指标进行研究,分析其发病特点和规律、暴露和防治情况,并与64例职业性TCE接触工人以及56例正常人进行比较。3、OMLDT诊断模型的建立和验证首先将2大影响血清蛋白/多肽指纹图谱的因素——样品处理和质谱检测条件进行了优化,主要包括整个实验的重复性评估、蛋白定量对模型的影响。然后按照一定标准选择OMLDT患者、TCE接触者和正常人群血清样品,采用MB-WCX联合MALDI-TOF-MS技术检测血清多肽指纹图谱,应用ClinProTools软件建立OMLDT疾病诊断模型,初步筛选OMLDT差异蛋白/多肽。然后用另一部分实验对象验证模型,评价模型的敏感性和特异性。进一步将急性期/接触者模型和急性期/正常人模型中的差异峰进行统计,以找到属于OMLDT的特征峰。4、OMLDT典型病例动态变化研究根据OMLDT的特征峰,分析7例患者各个时期血清多肽指纹图谱,了解整个病程中不同病期血清蛋白组学的动态变化规律,同时进一步筛选并初步验证OMLDT血清蛋白/多肽标志。结果1、临床调查研究结果OMLDT发病主要以年轻人为主,起病时不易引起医生和患者的重视而延误治疗。发病时主要表现为畏寒发热、纳差厌油腻、皮疹和肝损害,伴有眼损害。B超发现肝胆脾受损严重。绝大部分患者WBC、EO和CRP明显升高,RBC和HGB水平显著降低；大部分都是急性重度中毒性肝病,主要表现为蛋白水平降低,而胆红素和酶学指标水平明显升高；肾功能基本稳定。甲基强的松龙激素治疗有效,有7例出现了病情反跳,1例转院治疗,其余均治愈出院。职业调查发现OMLDT患者存在于不同车间不同环境中,发病主要原因是防护措施过于简单、车间通风不良、工作人数较多以及工作时间长。2、OMLDT诊断模型的建立和验证结果2.1血清多肽指纹图谱实验条件优化结果不管是日内重复性还是日间重复性,各次实验的血清多肽指纹图谱基本一致,绝大部分峰的CV值<40%,表明基于MB-WCX的MALDI-TOF-MS技术能够得到重复性高和稳定性好的血清多肽指纹图谱；同样的样本经过定量得到的血清多肽谱峰数要明显多于没有经过定量的,而且模型交互验证和识别能力也要基本高于未定量样本,但是敏感性和特异性却低于未定量样本。我们认为,定量样本用于建模和验证更加严谨、可靠。2.2急性期和正常人模型我们对OMLDT急性期患者和正常人血清多肽指纹图谱进行统计共得到158个峰,72个有统计学意义的峰,其中有52个差异峰。52个差异峰中,有28个相对于正常人是低表达的,有24个是高表达的。我们从2D分布图上明显看到m/z为2106和2135Da的2个差异峰能够很好地区分急性期患者和正常人。ROC曲线分析也表明m/z为2106和2135Da的2个差异峰AUC值最大,几乎接近1,能够很好地区分急性期患者和正常人。我们应用SNN算法进行识别分析后筛选出由3个m/z分别为2106.3、2134.5和3263.67Da构建的诊断模型,交叉验证和识别能力分别是94.44%和100%。进一步用另一部分实验对象对模型进行验证,敏感性和特异性分别是100%和66.7%。2.3急性期和接触者模型我们对OMLDT急性期患者和TCE接触者血清多肽指纹图谱进行检测共得到157个峰,72个有统计学意义的峰,其中有35个差异峰。35个差异峰中,有13个相对于TCE接触者是低表达的,有22个是高表达的。进一步通过2D峰分布图发现m/z为1450和5065Da的2个差异峰可以对两组样本进行有效区分,ROC曲线分析也表明这2个差异峰能够较好地区分急性期患者和接触者。我们应用SNN算法建立了由m/z为1450.33、1866.16、3262.39、4109.55、5064.85、5248.05、5956.57和6667.04Da共8个多肽峰组成的疾病诊断模型,交叉验证和识别能力分别是97.22%和100%。进一步用另一部分实验对象对模型进行验证,敏感性和特异性分别是81.3%和100%,说明建立的OMLDT急性期患者和TCE接触者诊断模型显示了良好的区分能力。2.4OMLDT特征峰分析结果我们将急性期/正常人模型和急性期/接触者模型中的差异峰进行统计,结果共得到21个相同的差异峰,并且其表达水平变化也是一致的。其中有9个相对于接触对照组和正常对照组是低表达的,有12个是高表达的。3、OMLDT典型病例动态变化研究结果在OMLDT21个特征峰中,我们发现4例病情反跳者在皮疹剥脱期、皮疹反跳期和恢复正常期3个时期内有4个蛋白/多肽峰的动态变化是基本一致的,m/z分别是4109、4267、5065和9287Da；3例非病情反跳者在急性皮疹期、皮疹剥脱期和恢复正常期3个时期内有2个蛋白/多肽峰的动态变化是完全一致的,m/z分别是4109和9173Da。而m/z为4109Da的特征峰在反跳组和非反跳组中均有出现,并且其表达水平随病程的变化呈现升高的趋势,提示其也许是OMLDT特有的血清学生物标志。结论1、OMLDT主要以畏寒发热、纳差厌油腻、皮疹和肝损害为主要特征；激素治疗有效；由接触TCE引起,发病也许跟个体遗传易感因素有关,为一种职业性免疫损伤疾病；职业防护措施有待进一步加强。2、本研究应用MB-WCX联合MALDI-TOF-MS技术结合ClinProToolsTM软件首次对OMLDT建立诊断模型并进行验证,得到较高的敏感性和特异性,筛选到了特异性差异蛋白/多肽,为临床早期诊断提供了参考。3、特征峰峰面积概率分布规律能够准确反映OMLDT患者不同病期蛋白/多肽水平的动态变化,为监测疾病病程提供了一种新的思路。