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2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid,2KGA)是食品添加剂D-异抗坏血酸(钠)的合成前体。膜结合葡萄糖脱氢酶(membrane bound glucose dehydrogenase,m GDH,EC 1.1.5.2)是2KGA生物合成过程中的关键酶,可催化氧化D-葡萄糖为D-葡萄糖酸。本论文对国内2KGA工业生产用菌球形节杆菌C224的m GDH进行了分离纯化和鉴定,系统研究了其酶学性质,初步开展了酶促反应动力学的研究,为后续的m GDH过量表达研究及2KGA高效生产菌株的构建提供了一定的理论依据。主要结论如下:(1)经过超声波破碎细胞、Triton X-114两相分离、丙酮沉淀、聚乙二醇6000(PEG 6000)沉淀、乙醇沉淀以及Hydroxyapatite Fast Flow吸附层析等步骤,从球形节杆菌C224中获得了比活为88.08 U/mg、纯化倍数达183.50倍的m GDH。(2)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacryamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析结果表明,球形节杆菌C224的m GDH是单体蛋白,相对分子质量大约为90000。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)分析结果证实,从球形节杆菌C224分离纯化的蛋白质确实为吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone,PQQ)依赖的m GDH,相对分子质量大约为87000。(3)酶学性质研究结果表明,用2,6-二氯靛酚钠—吩嗪硫酸甲酯(2,6-dichlorophenolindophenol-phenazine methosulfate,DCIP-PMS)作为电子受体时,球形节杆菌C224 m GDH的最适反应p H值为6.0;用铁氰化钾作为电子受体时,其最适反应p H值为5.0。该酶的最适反应温度为45℃;在p H 6.0~7.0和20~40℃条件下,m GDH具有较好的稳定性;m GDH具有广泛的底物谱,D-葡萄糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖、麦芽糖或D-木糖均可作为其反应底物;Mg2+对m GDH具有明显的促进作用,而Mn2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+及一些常用的有机溶剂(甲醇、乙醇、丙酮和正己烷)对该酶具有不同程度的抑制作用;低浓度的乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid,EDTA)即可完全抑制m GDH的活性,说明该酶是金属离子依赖性酶。(4)在p H 5.0、25℃条件下,以D-葡萄糖为底物,m GDH酶促反应的最大反应速率Vmax为192.31μmol/mg·min,Km为0.21 mmol/L;当底物为D-木糖时,m GDH酶促反应的最大反应速率Vmax为44.05μmol/mg·min,Km为0.34 mmol/L;D-半乳糖作为底物时,m GDH的最大反应速率Vmax为18.32μmol/mg·min,Km为0.46 mmol/L;麦芽糖作为底物时,m GDH的最大反应速率Vmax为19.05μmol/mg·min,Km为0.59 mmol/L。双底物酶促反应和产物抑制动力学研究结果表明:球形节杆菌C224 m GDH的催化反应动力学机制为乒乓机制,即在酶催化反应过程中,首先与m GDH结合的底物是PMS,当第一个产物PMSH释放后D-葡萄糖再与酶结合,释放第二个产物D-葡萄糖酸。