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背景与目的塑化剂,又称邻苯二甲酸酯类化合物(Phthalate Esters,PAEs),是一种环境内分泌干扰物,对生殖、肝肾功能、胚胎发育等多方面均有潜在的危害作用。目前,人们对塑化剂的研究主要集中在其对人体代谢以及生殖等方面,关于塑化剂对骨骼肌发育的影响鲜有报道。前期我们课题组研究发现塑化剂DEHP母体暴露后,仔鼠体重以及骨骼肌重量较对照组均明显减少,肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)在DEHP母体暴露的仔鼠肌肉中表达显著上调,提示MSTN可能在DEHP暴露引起的肌肉发育抑制中发挥作用。本研究利用Cre-lox P技术构建骨骼肌中MSTN基因特异性敲除小鼠模型,进一步研究MSTN在DEHP母体暴露引起子代肌肉发育抑制中的作用及相关分子机制。方法1.利用Cre-loxP技术构建骨骼肌中MSTN基因特异性敲除的小鼠模型,用PCR法进行基因型鉴定。2.在特定时间点(0、7、14、21天)分别测量野生型与MSTN基因敲除小鼠的体重,观察两组小鼠体重的变化;免疫荧光法检测两组小鼠腿部骨骼肌纤维横截面积的大小;RT-qPCR法检测两组小鼠股四头肌中Atrogin-1、MuRF-1等肌肉降解相关基因mRNA的表达。3.分别构建野生型、MSTN基因敲除孕鼠模型,分成4组:野生型+玉米油(WT-con组),野生型+DEHP染毒(WT-DEHP组),MSTN基因敲除+玉米油(KO-con组)以及MSTN基因敲除+DEHP染毒(KO-DEHP组),DEHP与玉米油均采用隔天灌胃的方法,从观察到阴栓时开始灌胃,灌胃时间至子代小鼠断奶(第21天),在特定时间(0、7、14、21天)分别测量小鼠体重,观察两组小鼠体重变化,称取骨骼肌重量,RT-qPCR法检测骨骼肌合成与降解相关基因m RNA的表达。4.为了进一步探讨DEHP影响骨骼肌发育的具体机制,采用CCK-8法检测不同浓度(0、62.5、125、250、500、1000μM)MEHP(DEHP活性代谢产物)处理不同时间(48、72、96 h)对骨骼肌细胞C2C12增殖的影响;RT-qPCR法检测MEHP对蛋白质合成与降解相关基因m RNA表达的影响;荧光素酶标记法检测MEHP对MSTN启动子的影响;采用siRNA干扰技术干扰C2C12细胞中的转录因子C/EBPδ,观察MEHP对其相关基因mRNA表达的影响。结果1.与对照组相比,MSTN基因敲除后仔鼠体重及骨骼肌重量均显著增加,尤以第7和21天最为明显(P<0.05);免疫荧光结果显示MSTN基因敲除组(KO组)仔鼠的肌纤维横截面积较对照组(WT组)增大(P<0.01);RT-q PCR结果提示KO组肌肉降解相关分子Atrogin-1和MuRF-1的mRNA表达水平较WT组下降(P<0.01)。2.在特定时间点(0、7、14、21天)分别检测4组仔鼠的体重及骨骼肌重量,结果显示WT-DEHP组仔鼠的体重与骨骼肌重量较WT-Con组明显降低,而KO-DEHP组与KO-Con组相比则降低不明显。3.RT-q PCR检测4组仔鼠相关基因表达情况,结果显示WT-DEHP组仔鼠的肌肉降解因子Atrogin-1和MuRF-1 mRNA表达水平较WT-Con组升高,肌肉合成因子MyoD和Myogenin表达下降,而KO-DEHP组仔鼠较KO-Con组的Atrogin-1和MuRF-1并没有明显升高,MyoD和Myogenin也没有明显下调;Western blot检测仔鼠肌肉,WT-DEHP组仔鼠的MyoD和p-Akt蛋白水平低于WT-Con组,而KO-DEHP组仔鼠MyoD和p-Akt蛋白水平较KO-Con组没有降低,这些结果均说明DEHP母体暴露抑制子代骨骼肌的发育通过了MSTN分子的介导。4.用MEHP(DEHP代谢产物)处理骨骼肌细胞C2C12,CCK-8实验结果显示,随着MEHP浓度的增加以及暴露时间的延长,C2C12细胞的增殖活性显著降低,说明MEHP对骨骼肌细胞C2C12的增殖有显著的抑制作用,且呈现时间和剂量依赖效应;荧光素酶标记结果显示MEHP组(125、500μM)的荧光相对表达量均较对照组高(P<0.05),说明MEHP激活了MSTN的启动子;同时,与动物实验结果一致,RT-qPCR结果显示C2C12细胞经MEHP处理后,MSTN、Atrogin-1和MuRF-1的m RNA水平表达均升高(P<0.05),而MyoD和Myogenin的表达均下调(P<0.05);此外,MEHP组中转录因子C/EBPδ的m RNA表达水平较对照组升高。5.利用siRNA技术干扰C2C12细胞中C/EBPδ的表达,再经MEHP处理,结果发现干扰C/EBPδ不仅明显抑制了MEHP对MSTN以及Atrogin-1、Mu RF-1等肌肉降解因子表达的上调,同时也抑制了MEHP对Myo D、Myogenin等肌肉合成因子表达的下调,说明转录因子C/EBPδ在MEHP上调C2C12细胞中MSTN表达中发挥作用。结论1.利用Cre-LoxP技术成功构建了骨骼肌中MSTN基因特异性敲除的小鼠模型。MSTN基因敲除导致仔鼠体重以及骨骼肌重量增加,肌纤维增大,其原因可能与肌肉降解因子Atrogin-1与MuRF-1等表达下调有关。2.MSTN在DEHP母体暴露引起子代肌肉发育抑制中发挥作用。MSTN敲除后,DEHP引起的子代肌肉发育抑制作用减弱,肌肉合成相关分子Myo D和Myogenin表达增加,肌肉降解相关分子Atrogin-1和Mu RF-1表达减少,Myo D和p-Akt蛋白水平增加。3.DEHP活性代谢产物MEHP通过影响转录因子C/EBPδ激活骨骼肌C2C12中MSTN的启动子,从而增加MSTN表达水平,引起骨骼肌细胞的萎缩。