论文部分内容阅读
目的:帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是常发于中老年人的中枢神经系统变性疾病,主要临床表现为震颤、强直、运动弛缓、姿势平衡障碍等运动症状,此外,常伴发抑郁、焦虑、便秘、睡眠障碍、认知功能减退等非运动症状。自噬是依赖溶酶体途径对胞质蛋白和细胞器进行降解的一种过程,是细胞进行自我保护的一种重要机制,自噬发生在基础生理状态下,参与细胞的基本生理过程,但也可以由不同种类的应激所诱发,然而过度的自噬会导致机能紊乱。研究表明,自噬失调与帕金森病的发病机制有关。艾司西酞普兰(escitalopram,ESC)是新型的选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(Selective Serotonin Reuptake Inhibitors,SSRIs),在临床用于广泛性焦虑、抑郁症的治疗,并有一定的神经保护作用,目前研究发现ESC可以在海马初级神经元细胞中激活泛素介导的自噬-溶酶体降解途。本研究旨在探讨ESC对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)处理的PC12细胞的保护作用及可能的作用机制。方法:根据研究目的将ESC(终浓度5μM、10μM、20μM、40μM、60μM、80μM)或/和MPTP(终浓度500μM、750μM、1000μM、1250μM、1500μM)加入到培养的PC12细胞中,以及在应用1m M的3-MA后通过MTS检测细胞存活率,Hoechst33258染色用荧光显微镜观察细胞凋亡情况,Western blot检测自噬标记物LC3B-Ⅱ、LC3B-Ⅰ和凋亡蛋白Bcl-2、Bax的表达情况。结果:1 MTS检测各组PC12细胞存活率1.1 MPTP对PC12细胞存活率的影响用500μM、750μM、1000μM、1250μM、1500μM的MPTP处理PC12细胞24h、48h、72h,PC12细胞的存活率呈现出剂量依赖性和时间依赖性。随着MPTP浓度的升高及时间的延长,PC12细胞存活率显著下降。1.2 ESC对PC12细胞存活率的影响用5μM、10μM、20μM、40μM、60μM、80μM的ESC处理PC12细胞,处理24h时,细胞存活率较CON组无统计学差异(P>0.05),虽然没有统计学差异,但可以看出细胞存活率有先上升后下降的趋势,在10μM时上升最明显。处理48h时,80μM的ESC对PC12细胞具有损伤作用,细胞存活率下降约14.3%,较CON组有统计学差异(P<0.05),其余浓度的ESC对PC12细胞存活率较CON组无统计学差异(P>0.05)。处理72h时,5μM、10μM和20μM的ESC增加细胞存活率,以10μM时增长最明显,增长约12%,60μM和80μM的ESC降低细胞存活率,分别下降了约18.7%和32.9%,与CON组比有统计学差异(P<0.05),40μM的ESC对PC12细胞存活率较CON组无显著差异(P>0.05)。所以大剂量的ESC也会引起细胞凋亡。1.3 ESC预处理对MPTP处理的PC12细胞存活率的影响用10μM、20μM的ESC预处理PC12细胞1h,再加1000μM的MPTP继续处理24h,以及5μM、10μM的ESC预处理PC12细胞1h,再加1000μM的MPTP继续处理72h,与MPTP组相比均能显著增加细胞存活率(P<0.05)。1.4自噬抑制剂3-MA对各组细胞存活率的影响ESC+MPTP+3-MA组细胞存活率(65.23±2.96%)较ESC+MPTP组细胞存活率(73.18±2.27%)降低,差异有统计学意义(P<0.05)。应用3-MA能显著抑制ESC预处理对PC12细胞的神经保护作用。2 Hoechst33258染色检测细胞凋亡情况Hoechst33258染色发现1000μM的MPTP组PC12细胞核明显固缩,细胞核呈现亮蓝色荧光。10μM的ECS组PC12细胞核较CON组未见明显改变,ESC预处理组较MPTP组能显著减少细胞核固缩的现象,ESC预处理可以降低细胞凋亡率,且差异有统计学意义(P<0.05)。3 Western blot检测LC3B-Ⅱ/Ⅰ及Bcl-2/Bax蛋白表达情况Western blot检测研究发现MPTP组LC3B-Ⅱ/Ⅰ水平明显增加,Bcl-2/Bax较CON组显著下降,10μM的ESC预处理后LC3B-Ⅱ/Ⅰ水平较MPTP组升高,而Bcl-2/Bax显著下降,应用自噬抑制剂3-MA后,LC3B-Ⅱ/Ⅰ水平和Bcl-2/Bax水平均出现下降。说明ESC通过PI3K/Akt/Bcl-2途径对MPTP处理的PC12细胞发挥神经保护作用。结论:1.一定浓度的ESC处理适宜的时间能够促进细胞存活。2.ESC预处理可以增加PC12细胞存活率,降低MPTP处理的PC12细胞的凋亡率,表明了ESC有一定的神经保护作用。3.ESC通过PI3K/Akt/Bcl-2途径对MPTP处理的PC12细胞发挥神经保护作用,自噬抑制剂3-MA抑制PI3K/Akt/Bcl-2途径,抑制保护作用,推测保护机制可能部分与细胞自噬有关。