外伤后细菌性致死性肉芽肿(Fatal bacterial granuloma after trauma,FBGT)是一种慢性致死性感染性疾病,绝大多数继发于轻微的面部皮肤外伤,1996年由我科高天文教授发现并命名。在国家自然科学基金项目(30271196)支持下,已明确FBGT的病原菌为痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes, P. acnes),患者的死亡原因系P. acnes引起的脑感染。课题组在病原体培养及药物敏感试验的基础上,对收治的FBGT患者进行大量、联合、交替的抗感染治疗,但仍有多位患者死亡。阐明体外药敏试验敏感的抗生素在临床体内治疗中效果不佳,成为揭示FBGT发病机理和有效挽救患者生命的关键问题。生物膜(biofilm,BF)是细菌的一种生存模式,其中的细菌对抗生素耐药性显著升高。BF耐药理论能合理解释FBGT患者P. acnes体外培养药敏试验结果和临床治疗效果的不一致性。本课题组齐显龙博士在国家自然科学基金(30670117)资助下成功在体外构建了P. acnes BF模型,通过扫描电镜观察初步确定其结构特点,并证实BF能够大大增加P. acnes对林可霉素等抗生素的耐药性,初步解释了FBGT患者病程中P. acnes体外培养药敏试验结果和临床治疗效果的不一致性。但是迄今为止,国内外仍缺乏对P. acnes BF三维(three dimensional,3D)立体结构的详细观察和了解。宿主对P. acnes的免疫反应早期是单核巨噬细胞的固有免疫反应,后期主要是以Th1为主的获得性免疫。通常P. acnes会被单核巨噬细胞吞噬并杀伤,不能导致慢性肉芽肿性感染,而FBGT中P. acnes能够在组织中长期存活,并不能被呈现酸性pH的溶酶体杀伤。结合本课题组既往的实验结果和课题思路,在宿主单核巨噬细胞和Th1型细胞免疫功能缺陷的条件下,P. acnes在溶酶体中的酸性环境中生存,可能会进一步产生BF,可以在一定程度上解释FBGT发病机理。为此,我们从P. acnes BF3D模型重建及BF与微环境pH相互作用两方面进行研究,期望能为FBGT发病及耐药机制的明确及有效治疗打下一定基础,并推动P. acnes相关疾病的研究。目的1、通过多重荧光染色、激光共聚焦显微镜(confocal scanning laser microscopy ,CSLM)和图像3D模型重建技术,对P. acnes BF中活菌、死菌及细胞外多聚物(extracellular polymeric substances,EPS)分别进行标记,观察不同孵育时段BF的变化规律,进一步明确P. acnes BF内部的详细结构及特征。2、在不同pH值微环境中构建P. acnes BF的体外模型,分析微环境pH在不同时间内对P. acnes形成BF的影响和对BF中P. acnes增殖的作用,并反向观察P. acnes BF对微环境pH的影响。进一步探讨P. acnes对不同pH值微环境的耐受及形成BF的能力,为阐明P. acnes的致病力提供新的证据。实验方法1 P. acnes BF三维模型重建。1.1在玻璃盖玻片表面构建体外P. acnes BF模型,所选的观察时间点分别为5d、10d、15d和20d。1.2用针对活菌的荧光染料二乙酸荧光素(fluorescein diacetate,FDA)和荧光标记的细菌多糖特异性植物凝集素罗丹明标记的伴刀豆素A(rhodamine-ConA),对P. acnes活菌、死菌及大分子EPS中的多糖分别进行标记。1.3 CLSM观察不同时间段BF内部P. acnes活菌、EPS及死菌的变化规律;采用软件进行3D重建,明确P. acnes BF表面及内部详细结构的特点。2 P. acnes BF和微环境pH相互作用。2.1在96孔板中构建不同pH值微环境中体外P. acnes BF模型。pH分3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0共15组,BF形成时间分为24h、48h、72h和96h,无菌pH7.0培养液作为阴性对照,空白孔作为空白对照。2.2不同pH值及培养时间对P. acnes形成BF的作用。使用结晶紫(crystal violet,CV)比色法,结合于黏附的细菌及其BF中,用33%乙酸水溶液将结合的CV溶解后,观察590nm波长OD值,分析不同pH微环境和不同孵育时间对P. acnes形成BF的作用。2.3不同pH值及孵育时间对BF中P. acnes增殖的作用通过2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐-吩嗪硫酸甲酯(XTT-PMS)比色法,比较pH和培养时间对BF中P. acnes增殖的作用,探讨P. acnes在体外不同pH微环境中的生存能力及形成BF的规律,为研究P. acnes抵御宿主体内不同器官、组织、细胞如皮脂、胃液、胆汁及吞噬细胞内的杀伤作用提供理论依据。2.4 P. acnes BF对培养基pH值的影响通过检测不同培养时间之后,液体培养基pH值的改变,探讨P. acnes在形成BF过程中对局部微环境的主动调节作用。结果与讨论本研究在体外构建P. acnes BF模型,除不同pH值之外未增加其他微环境的干预因素,在实验室体外培养条件下观察P. acnes及其BF自然发展过程的特点和规律。1 P. acnes BF3D模型重建1.1长时间培养P. acnes BF内部结构观察。5d至20d的培养过程中,在P. acnes BF内部单一层面扫描发现以下特点:(1)BF中的活细菌随着BF的发展而逐渐减少,并逐渐向集落状聚集。P. acnes BF在达到成熟期后,其内部一直有较多活细菌存在,但当BF发展到20d时,活菌数目会明显减少,主要分布特征为呈菌落状聚集。(2)EPS的聚集趋势先于活细菌发生,后期形成高密度山脊状结构。P. acnes BF的EPS随着培养时间的延长,从散在颗粒状逐渐融合聚集,最后形成高密度山脊状。(3)成熟期P. acnes BF的发展过程中,活细菌逐渐在厚密的EPS部位内部聚集成菌落。P. acnes BF发展到晚期,其内部活菌逐渐减少,活细菌的分布逐渐和EPS的聚集趋势一致,到培养20d时绝大多数活细菌都被厚密EPS包裹。还可见未被EPS包裹的活细菌,这些游离的细菌很可能就是BF发展到后期释放出的浮游状态细菌。1.2 P. acnes BF3D模型重建。培养20d后,P. acnes BF表面几乎全部被不同厚度的EPS所包裹。典型蘑菇状突起部分EPS尤为明显,在蘑菇样结构下方可以观察到宽大的通道结构和突起部向基底部平缓延伸的部分。在P. acnes BF的内部结构中,活细菌大部分呈小菌落状聚集在蘑菇样结构内,表面覆盖着厚密的EPS,在BF较薄的部分发现了活细菌和EPS相互交织融合的结构,活细菌菌体较小。在BF培养的过程中,随着时间的延长,BF中活P. acnes明显减少而EPS逐渐增加,可能由于增多的EPS在保护P. acnes的同时也减少了外环境中营养物质的传输,使部分P. acnes由于营养缺乏而死亡。本实验发现的活菌减少而BF增大,活菌在EPS厚密部分内部聚集的现象可能和细菌的密度感应系统(quorum sensing system, QSS)的作用相关。在实验室体外培养条件下,孵育20d后P. acnes在光面玻璃表面形成了BF,而且在蘑菇样结构内部厚密的EPS保护下仍有活细菌菌落生存,充分证明P. acnes的生存能力很强,有引起慢性迁延感染的能力,并产生BF抵御抗生素的杀伤作用。提示临床工作中,一旦出现P. acnes感染,应早期足量使用敏感抗生素,防止BF形成,导致难治性感染的出现。2 P. acnes BF和微环境相互作用研究。2.1不同pH值及培养时间对P. acnes形成BF的作用。各培养时段内不同pH组形成BF的量有明显差异。从培养24h时开始,pH3.5-9.0组在590nm OD值均随时间有不同程度的升高,在96h BF的形成到达前期研究确定的平台期时,只有pH 4.0-8.5明显高于阴性对照组和pH 3.0-3.5、pH 9.0-10.0组(P<0.05)。各时段内pH5.5-7.0形成BF量始终明显高于其他组(P<0.05),峰值均在pH6.5。各pH组形成BF的速度也有明显差异。pH4.5-7.0从24h到96h形成BF的速度明显高于其他pH组(P<0.05)。2.2不同pH值微环境和孵育时间对BF形成过程中P. acnes增殖的作用。不同pH和孵育时间对BF形成过程中P. acnes增殖的作用与对形成BF作用规律相似。96h时pH 4.0-8.5 P. acnes的增殖明显高于阴性对照组和pH 3.0-3.5、pH 9.0-10.0组(P<0.05),各时段内pH5.5-7.0组P. acnes的增殖明显高于其他组(P<0.05),峰值在pH6.0和pH6.5,两组之间没有显著统计学差异(P>0.05)。pH4.5-7.5组P. acnes随时间增殖的速度明显高于其他组(P<0.05)。2.3不同孵育时间之后,培养液pH值的变化。培养96h后检测各组培养液pH的改变,发现pH3.0-5.5组pH值均有不同程度的增加,而pH7.5-8.5组则有所减小,但经统计学检验无明显差异(P>0.05)。P. acnes能在pH 4.0-8.5形成BF,最适宜范围在pH4.5-7.0,其中在pH 5.5-7.0 P. acnes能较快的形成BF,证明中性偏酸环境适合P. acnes的扩增并形成BF。目前文献报道和P. acnes有关的疾病主要有FBGT、痤疮、结节病、感染性心内膜炎、颅内感染、骨关节术后感染、原发性胆汁性肝硬化、前列腺增生、眼内炎等,累及皮肤、血液、脑、骨、肝脏、眼等多种器官组织。人体大部分组织和体液均在pH7.0左右,上述人体组织其局部微环境pH均在4.0-8.5之内,适合P. acnes生存和扩增。BF的形成,一方面使P. acnes牢固黏附在组织中,另一方面使P. acnes能够有效提高对抗生素等抗菌药物的耐药性,从而在组织中形成慢性迁延的感染。细菌对环境的适应能力很强,包括一些强酸强碱的极端恶劣环境。本研究发现,培养96h后培养液pH值均向中性的改变无统计学差异,但是这提示P.acnes可能具有主动调节微环境的功能。P.acnes等细菌对微环境特别是pH的适应与调节的机制仍需要进一步深入探索。溶酶体内各种酶类均属于酸性水解酶,反应的最适pH值为5.0左右,如果溶酶体功能障碍,则不能保持内部酸性环境。本研究证实P. acnes能够在pH4.0生存并形成BF,即P.acnes可以在和正常溶酶体pH相同的微环境中存活。本研究结果填补了P.acnes及其BF和微环境pH相互关系研究的部分空白,为P.acnes感染性疾病发病机理和抗感染治疗提供了一定的理论依据。结论1本研究通过对新疾病FBGT病原体P.acnes BF体外模型的3D重建和分析,进一步深入阐明了P.acnes BF内部结构及其发展过程和形态特点。2证实了P.acnes具有在pH4.0-8.5微环境中生存、增殖并形成BF的能力,可以部分解释P.acnes在人体多种器官和组织中引起感染并产生抗生素耐药的原因;支持了FBGT临床治疗抗生素耐药系BF所致,为P.acnes感染性疾病发病机理和抗感染治疗提供了一定的理论依据。